铜绿假单胞菌中对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因的筛选及研究

发布时间：2017-03-30 08:25

  本文关键词：铜绿假单胞菌中对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因的筛选及研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是最常见的引起医院内感染的机会致病菌,对免疫力低下的人群易引起感染,特别是在器官移植病人、烧伤病人和肺纤维囊肿病人体内极易引起感染。由于它对几乎所有已知的抗生素都有很高的固有和获得性耐药,使目前临床治疗更加困难。 碳青霉烯类抗生素具有较强的抗菌活性和较低的毒性,是当前临床上治疗PA感染的重要抗生素。由于该类抗生素在临床上大量使用,PA对碳青霉烯类抗生素的耐药率随之迅猛提高,给临床治疗带来巨大挑战。因此,对该类抗生素耐药机制的研究迫在眉睫。 为了探索PA对碳青霉烯类抗生素耐药机制及寻找其耐药相关基因,本研究中我们从PAO1的全基因组水平出发,通过构建含30000多个克隆的转座突变体文库,筛选了200多株分别对亚胺培南、美罗培南和比亚培南耐药及敏感突变株,并通过随机PCR、核苷酸测序及序列比对的方法确定了突变体中转座子的插入位点,获得了48个与碳青霉烯类抗生素耐药相关的基因。其中有38个新的与碳青霉烯类耐药相关基因,包括13个class4类,其余25个是首次发现与碳青霉烯类抗生素耐药相关的基因。对这些新基因的发现,不仅有利于全面了解PA的耐药机制调控网络,更为有效治疗PA感染提供了新的思路。 在所筛选的突变体中,有两株菌被确定为PA0011转座突变体,对美罗培南和比亚培南都耐药。该基因编码2-OH-十二烷酰转移酶(2-OH-lauroytransferase),参与细菌外膜的合成。通过构建PA0011基因的敲除突变体,主要探索了PA0011基因对铜绿假单胞菌耐药性与致病性的影响。研究发现PA0011与多种抗生素耐药相关,包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内脂类、青霉素类、四环素类、环丙沙星类及粘菌素类等。通过实验表明,PA0011对外膜完整性和稳定性的维持具有重要作用,从而导致该基因突变体对抗生素的抗性降低。PA0011基因的表达受温度的调节,在21℃条件下比37℃的表达水平更高。温度还影响突变体对抗生素的敏感性程度,在21℃条件下比37℃突变体对抗生素更敏感。 通过体内及体外实验发现PA0011基因突变能够导致PA毒性降低。内毒素分析表明,毒性的降低部分是由于PA0011基因突变降低了PA的内毒素活性。此外PA0011基因突变还会导致一些毒性因子表达降低,如PA的泳动能力。但该基因不影响人血清和小鼠巨噬细胞对PAO1的敏感性。 在沙门氏菌和铜绿假单胞菌中,LPS-O抗原修饰与TTSS毒性因子分泌密切相关。我们研究表明,铜绿假单胞菌LPS的酰基化修饰也与TTSS毒性因子的表达相关。
【关键词】：铜绿假单胞菌 碳青霉烯类抗生素 耐药性 致病性 PA0011
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.991
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 图目录10-11
• 表目录11-12
• 第一部分 引言12-23
• 1.1 铜绿假单胞菌及其对碳青霉烯类抗生素耐药性研究12-14
• 1.1.1 铜绿假单胞菌12
• 1.1.2 碳青霉烯类抗生素12
• 1.1.3 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制的研究现状12-14
• 1.2 铜绿假单胞菌的致病性14-18
• 1.3 革兰氏阴性菌的外膜18-19
• 1.3.1 外膜的通透性18-19
• 1.3.2 外膜的稳定性19
• 1.4 革兰氏阴性菌外膜结构与其耐药性的关系19-21
• 1.4.1 外膜蛋白与细菌耐药的关系19
• 1.4.2 外膜组分类脂A的修饰与细菌耐药的关系19-21
• 1.5 抗生素的分类及对PA治疗的应用21
• 1.6 研究内容21-22
• 1.7 研究意义22-23
• 第二部分 实验材料和方法23-37
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 菌株和质粒23-24
• 2.1.2 培养基配制及使用24
• 2.1.3 抗生素及其使用24-25
• 2.1.4 试剂和仪器25
• 2.2 基本实验方法25-37
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备25
• 2.2.2 铜绿假单胞菌感受态细胞制备25
• 2.2.3 电转化25-26
• 2.2.4 酶切和连接反应26
• 2.2.5 PA0011基因敲除突变体的构建26-28
• 2.2.6 PA0011基因表达报道载体的构建28-29
• 2.2.7 PA0011基因敲除突变体的互补实验29-30
• 2.2.8 PA0011基因的过表达实验30-31
• 2.2.9 转座突变体库的构建31
• 2.2.10 抗生素MIC检测及耐药突变菌株的筛选31-32
• 2.2.11 突变体插入位点的确定32-33
• 2.2.12 PAO1(△0011)对多种抗生素敏感性检测33
• 2.2.13 外膜渗透性和稳定性检测33
• 2.2.14 果蝇感染实验33-34
• 2.2.15 细胞毒性实验34-35
• 2.2.16 LPS提取和纯化35
• 2.2.17 细菌运动性检测35
• 2.2.18 血清敏感性检测35
• 2.2.19 巨噬细胞存活实验35-36
• 2.2.20 蛋白提取36-37
• 第三部分 结果37-50
• 3.1 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因的筛选37-40
• 3.1.1 转座突变体库的筛选结果37-38
• 3.1.2 耐药相关基因的确定38-40
• 3.1.3 不同筛选研究中基因的比较40
• 3.2 PA0011基因与抗生素耐药性的关系40-44
• 3.2.1 PAO1(△0011)对多种抗生素敏感性增加41-42
• 3.2.2 温度影响PA0011基因的表达及其对抗生素敏感性42-43
• 3.2.3 PA0011基因影响铜绿假单胞菌外膜结构43-44
• 3.3 PA0011铜绿假单胞菌致病性的关系44-50
• 3.3.1 PAO1(△0011)降低了对果蝇的感染44
• 3.3.2 PA0011对细胞毒性的影响44-45
• 3.3.3 PA0011影响细菌内毒性的活性45-46
• 3.3.4 PA0011不影响正常人血清和小鼠巨噬细胞的敏感性46
• 3.3.5 PA0011对铜绿假单胞菌毒性因子的影响46-50
• 第四部分 结果与讨论50-52
• 4.1 结果50
• 4.2 讨论50-52
• 参考文献52-61
• 致谢61-62
• 硕士期间研究成果62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 宋宏新;刘晓阳;李宏;;改良热酚水法制备大肠杆菌O157:H7脂多糖抗原的研究[J];食品科学;2006年10期

2 康海泓;杨倩;;细菌Ⅲ型分泌系统装配的研究进展[J];畜牧与兽医;2010年04期

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