乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、戊肝病毒ORF2基因片段NE 2 在番茄中的表达及免疫活性

发布时间：2022-07-11 11:28

　　本研究以番茄子叶和下胚轴为材料，以Gus瞬时表达效率为指标，系统研究了农杆菌介导的番茄遗传转化的影响因素，在此基础上建立并优化了番茄“羞女”品种的遗传转化体系；构建乙型肝炎病毒表面抗原基因（HBsAg）、戊型肝炎病毒ORF₂基因片段NE₂（HEV-NE₂）的植物表达载体，利用已建立的转化体系将其导入番茄，获得了经PCR和Southern杂交证实的转基因植株。ELISA检测结果显示在番茄中表达的目的蛋白具有较好的免疫活性；动物试验结果初步表明，用转基因番茄表达的HBsAg口服或肌注初免过的小鼠，均有不同程度的加强免疫效果。展示了用番茄研制乙肝、戊肝口服疫苗的美好前景，为推动转基因植物口服疫苗走向实用化提供实验基础和理论指导。 1．植物表达载体构建：利用含GUS和去GUS的中间载体pCAMBIA1301和pCAMBIA1300构建了乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、戊肝病毒ORF₂基因片段NE₂的植物表达载体p1301HBs、p1300HBs、p1301NE₂

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
目录
中文摘要
英文摘要
前言
    1 转基因植物的研究及其产业化进展
        1.1 转基因植物的优越性
        1.2 转基因植物的转化方法
        1.3 转基因植物研究进展
        1.4 转基因植物产业化现状
        1.5 转基因植物领域中存在的问题
    2 转基因番茄研究进展
        2.1 番茄品种改良的基因工程研究概况
        2.2 利用转基因番茄生产药用蛋白的研究
    3 植物基因工程疫苗的研究进展
        3.1 转基因植物疫苗的表达系统
        3.2 几种主要转基因植物疫苗的研究概况
        3.3 转基因植物疫苗中存在的问题及相应对策
    4 肝炎病毒疫苗的研究进展
        4.1 乙型肝炎病毒疫苗
        4.2 戊型肝炎病毒疫苗
    5 本研究的目的、意义和研究内容
材料和方法
    1 材料
    2 方法
结果与分析
    1 植物表达载体的构建与鉴定
    2 双元质粒载体转化农杆菌及农杆菌转化子的鉴定
    3 番茄遗传转化体系的建立和优化
        3.1 外植体接种后形态变化
        3.2 不同部位外植体形成愈伤组织的差异
        3.3 不同培养基对愈伤组织和不定芽形成的影响
        3.4 番茄外植体对抗生素的敏感性试验
        3.5 转化条件的优化
        3.6 优化条件下的转化流程及抗性苗的获得
    4 外源基因整合、表达的检测
        4.1 报告基因（GUS）检测结果
        4.2 目的基因PCR检测
        4.3 Southern杂交
        4.4 转化植株中目的基因表达活性及表达量的检测
            4.4.1 植物外源蛋白HBsAg的ELISA活性检测及定量
            4.4.2 植物外源蛋白HEV-NE2的ELISA活性检测
    5 转基因植物的扩繁与移栽
    6 转基因植物表达的HBsAg的免疫原性
        6.1 植物蛋白粗提液的分离、纯化
        6.2 小鼠免疫试验结果
讨论
    1 关于转基因植物中的报告基因—GUS基因
        1.1 Gus作为报告基因的可靠性
        1.2 Gus基因的安全性
    2 转基因植物中基因沉默问题及改进措施
        2.1 转基因沉默的机制
        2.2 防止基因沉默的对策
    3 转基因苗扩繁中培养物的褐化问题
    4 小鼠免疫试验中存在的问题及改进措施
    5 番茄做为乙肝、戊肝植物口服疫苗的前景
    6 植物口服疫苗产业化发展的建议
小结
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]果树转基因研究进展[J]. 林顺权,宋刚,马英,曾黎辉,吕柳新.  园艺学报. 2001(S1)
[2]转基因植物的现状[J]. 王亮,游松.  沈阳药科大学学报. 2001(03)
[3]我国研制成功戊型肝炎疫苗[J]. 灵晓.  中华医学杂志. 2001(02)
[4]戊型肝炎病毒结构区基因ORF2在Pichia pastoris中的分泌表达[J]. 佟玉品,毕胜利,张明程,鲁健,詹美云.  中华实验和临床病毒学杂志. 2000(04)
[5]转基因植物中报告基因gus的表达及其安全性评价[J]. 王忠华,夏英武.  生命科学. 2000(05)
[6]转基因植物的研究及其产业化进展[J]. 曹孟良.  湖南农业科学. 2000(04)
[7]含与不含前导序列的乙肝病毒表面抗原在转基因番茄中表达的研究[J]. 赵春晖,王荣,赵长生,王关林,田波.  农业生物技术学报. 2000(02)
[8]农业生物技术产业发展问题的思考[J]. 黄其满.  高技术通讯. 2000(06)
[9]转基因番茄防龋疫苗的基础研究 Ⅰ.变形链球菌pac基因唾液粘附区植物表达质粒的构建[J]. 蒋少云,凌均启.  口腔医学纵横. 2000(02)
[10]迎接21世纪农作物生物技术的挑战[J]. 范云六,张春义.  生物技术通报. 1999(05)



本文编号：3658080