成年狨猴肾脏细胞体外培养体系的建立及CRISPR/Cas9基因编辑的应用

发布时间：2022-10-15 14:29

　　目的建立成年狨猴肾脏细胞体外培养的培养体系,并将Cas9编辑系统初步应用于所培养的狨猴肾脏细胞,建立检测sgRNA切割活性的体系。方法取成年的狨猴肾脏,采用贴壁法、消化法得到狨猴肾脏细胞。对细胞进行生长曲线测定、转染试剂（Viafect和Lipo2000）及抗性（嘌呤霉素和杀稻瘟菌素）浓度筛选,将SIRT1的sgRNA质粒和Cas9质粒共转染狨猴细胞,提取基因组并对基因修饰目的片段扩增,并将扩增产物进行测序。结果建立狨猴肾脏细胞体外培养体系;ViaFect转染试剂转染率大于60%;细胞抗性筛选适宜浓度嘌呤霉素4μg/mL,杀稻瘟菌素8μg/mL;测序结果表明,从sgRNA的PAM序列附近开始出现突变峰,证明sgRNA成功引入突变。结论成功建立了狨猴肾脏细胞的体外培养、细胞转染和抗性筛选体系;CRISPR/Cas9可以用于狨猴肾脏细胞编辑,为基因修饰狨猴靶点选择提供依据。 

【文章页数】：5 页

【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 实验动物
    1.2 主要试剂及仪器
    1.3 实验方法
        1.3.1 狨猴肾脏原代细胞培养
        1.3.2 传代培养
        1.3.3 生长曲线的测定与绘制
        1.3.4 细胞冻存与复苏
        1.3.5 药物抗性筛选与转染
        1.3.6 CRISPR-Cas9在狨猴原代肾脏细胞的应用研究
    1.4 数据与图片
2 结果
    2.1 原代肾脏细胞培养
    2.2 肾脏细胞培养传代
    2.3 生长曲线的测定与绘制
    2.4 细胞冻存与复苏
    2.5 药物抗性筛选与转染
    2.6 CRISPR-Cas9在狨猴细胞的应用研究
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]灵长类动物基因编辑技术研究进展[J]. 康宇,陈永昌,牛昱宇.  生命科学. 2015(01)
[2]小鼠肾细胞分离培养方法的改良[J]. 张丽娇,田园僮,丁亦男,魏健.  黑龙江畜牧兽医. 2013(07)
[3]原代肝、肾细胞培养在保健食品原料毒性筛选中的应用[J]. 戴伟,顾光,高芃,徐海滨.  中国食品卫生杂志. 2010(03)
[4]SIRT1与神经变性疾病[J]. 王颖,高静,钱进军.  生命科学. 2010(04)
[5]大鼠肾细胞分离制备及培养方法的比较[J]. 顾光,高芃,支媛,殷召雪,隋海霞,刘珊,周宇红,徐海滨.  卫生研究. 2005(05)
[6]肾组织上皮细胞的培养及其应用进展[J]. 熊祖应,梅俏,徐叔云.  中国药理学通报. 1999(04)

博士论文
[1]利用CRISPR/Cas9系统构建基因编辑猴及CRISPR/Cas9系统应用优化[D]. 崔益强.南京医科大学 2017



本文编号：3691475