重组人β-防御素的表达策略研究

发布时间：2022-10-18 19:43

　　人β-防御素是近来年发现的具有广谱抗菌活性并在机体抵御外来微生物入侵中起防御作用的一类阳离子抗菌肽。 本论文研究了使用基因工程技术重组表达可溶性人β-防御素的方法。以人β-防御素-2（HBD-2）为示例蛋白，建立了从获得基因、载体构建，到表达体系选择、表达优化及放大，直至产物分离纯化、生物活性测定等整套工艺，并将其应用于HBD-3及HBD-4的重组表达。 从人体炎症皮肤组织（尖锐湿疣）中克隆获得了HBD-2的人源基因，并对密码子进行了分析及优化，合成了无宿主稀有密码子的基因。两基因的对比表达实验表明，合成基因的蛋白表达量约是人源基因表达量的9倍。 构建了多种HBD-2表达载体，分别在大肠杆菌、毕赤酵母菌及枯草芽孢杆菌3个表达系统中进行表达，经表达效果对比，选定了大肠杆菌系统的一个融合表达体系用于HBD-2的重组生产。 进行了大肠杆菌HBD-2融合表达体系的表达优化及放大工作。通过对摇瓶表达条件的研究，获得了如下的优化培养条件：培养基为MBL，培养温度为28℃，装液量为12％（v／v）... 

【文章页数】：126 页

【学位级别】：博士

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目录
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 文献综述
    1.1 引言
    1.2 人防御素的组织分布
    1.3 人防御素的分子生物学特征
        1.3.1 分子结构
        1.3.2 基因结构及其定位
        1.3.3 基因的表达调控
        1.3.4 翻译后修饰
    1.4 人防御素的抗菌活性及作用机理
        1.4.1 抗菌活性
        1.4.2 作用机理
    1.5 人防御素的医学和药用价值及前景展望
        1.5.1 医学及药用价值
        1.5.2 前景展望
    1.6 基因工程生产人防御素
        1.6.1 国内外研究进展
        1.6.2 表达系统的比较
        1.6.3 大肠杆菌中的融合表达体系
        1.6.4 大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白
    1.7 小结
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 质粒
        2.1.2 菌种
        2.1.3 抗体
        2.1.4 工具酶及试剂盒
        2.1.5 培养基
        2.1.6 主要仪器
    2.2 实验及分析方法
        2.2.1 分子克隆相关实验
        2.2.2 大肠杆菌菌体浓度测定
        2.2.3 大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取
        2.2.4 蛋白浓度测定
        2.2.5 SDS-PAGE电泳
        2.2.6 Western Blotting分析
        2.2.7 还原糖浓度测定
第三章 人β-防御素-2的基因克隆、密码子优化及多拷贝串联基因的构建
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验方法
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 逆转录-PCR
        3.3.2 密码子优化
        3.3.3 全基因合成
        3.3.4 克隆载体构建
        3.3.5 基因序列测定
        3.3.6 定点突变
        3.3.7 多拷贝串联基因构建
        3.3.8 添加His-Tag
    3.4 小结
第四章 在大肠杆菌中表达人β-防御素-2
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验方法
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 HBD-2表达载体的构建及目标蛋白表达
        4.3.2 两种基因(人源、合成)的比较
        4.3.3 串联基因对重组菌生长及质粒稳定性的影响
    4.4 小结
第五章 在毕赤酵母及枯草芽孢杆菌中表达人β-防御素-2
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 实验方法
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 在毕赤酵母中表达HBD-2
        5.3.2 在枯草芽孢杆菌中表达HBD-2
        5.3.3 三种宿主菌表达情况的比较
    5.4 小结
第六章 重组人β-防御素-2的表达优化及放大
    6.1 引言
    6.2 材料与方法
        6.2.1 实验材料
        6.2.2 实验方法
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 培养基的选择
        6.3.2 培养温度的选择
        6.3.3 装液量的选择
        6.3.4 诱导剂终浓度的选择
        6.3.5 诱导时机的选择
        6.3.6 表达时间的确定
        6.3.7 表达载体的改建
        6.3.8 表达的放大
        6.3.9 重组菌发酵的动力学研究
    6.4 小结
第七章 重组人β-防御素-2的分离纯化
    7.1 引言
    7.2 材料与方法
        7.2.1 实验材料
        7.2.2 实验方法
    7.3 结果与讨论
        7.3.1 亲和层析分离融合蛋白
        7.3.2 肠激酶裂解融合蛋白
        7.3.3 阳离子交换层析分离重组HBD-2
        7.3.4 重组HBD-2的精制
        7.3.5 渗透冲击法提取融合蛋白
        7.3.6 分离工艺总结
    7.4 小结
第八章 重组人β-防御素-2的活性测定
    8.1 引言
    8.2 材料与方法
        8.2.1 实验材料
        8.2.2 实验方法
    8.3 结果与讨论
        8.3.1 固体平板扩散法
        8.3.2 液体培养法测定抑菌活性
        8.3.3 抑菌效果与培养时间的关系
        8.3.4 抑菌效果与NaCl浓度的关系
    8.4 小结
第九章 在大肠杆菌中表达人β-防御素-3，4
    9.1 引言
    9.2 材料与方法
        9.2.1 实验材料
        9.2.2 实验方法
    9.3 结果与讨论
        9.3.1 密码子优化
        9.3.2 全基因合成
        9.3.3 表达载体的构建
        9.3.4 重组目标蛋白表达
    9.4 小结
结论
致谢
论文发表情况


【参考文献】：
期刊论文
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[2]细胞因子人MK基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达（简报）[J]. 黄建,林万敏,罗祖玉,谢毅.  实验生物学报. 2001(02)
[3]重组人β-防御素基因在COS-7细胞的转染表达[J]. 蔡绍晖,杜军,陈新年,黄宁,王伯瑶.  华西医科大学学报. 2000(04)
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[5]在大肠杆菌中表达人防御素-1[J]. 张满朝,郑国,许政凯,洪盂民.  生物化学杂志. 1997(03)
[6]人防御素-1转基因烟草的获得及其抗TMV的初步观察[J]. 张满朝,郑国锠.  Acta Botanica Sinica. 1997(06)
[7]含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用[J]. 张智清,姚立红,侯云德.  病毒学报. 1990(02)



本文编号：3692935