组蛋白乙酰化酶与腺病毒E1A的复合体结构及其功能研究

发布时间：2023-04-01 14:33

　　p300/CBP及其相关因子PCAF (p300/CBP associated factor,也被称为KAT2B)有乙酰转移酶活性,能通过乙酰化组蛋白和一些非组蛋白成分的方式参与基因的转录调控。与大多数典型的转录辅激活因子相同,它们能在转录因子和基本转录复合物之间起到连接作用。p300/CBP、PCAF与细胞周期调控、细胞凋亡以及癌症的发生、发展等过程之间有着直接的联系。 Marmorstein等人已经获得的PCAF的HAT结构。在本论文中,我们发现PCAF HAT结构域可通过四个螺旋的疏水性相互作用和B折叠延伸形成二聚体结构。DSS实验发现对相互作用面上关键氨基酸残基进行定点突变,这些突变体形成二聚化能力减弱,说明这些氨基酸残基对HAT二聚化的形成起关键作用。pulldown、静态光散射和动态光散射等实验证实在溶液中HAT以二聚体形式存在,且高浓度状态下才能检测到二聚体。与野生型HAT相比,HAT突变体的乙酰转移酶活性发生变化,这说明PCAF的二聚化对其乙酰转移酶活性起到调节作用。总之,一系列实验证明获得的PCAF HAT在溶液中主要以单体形式存在,少数以二聚体形式存在。 腺病毒E1...

【文章页数】：135 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
目录
Table of Contents
第一章 前言
    1.1 组蛋白修饰
    1.2 组蛋白乙酰基转移酶
        1.2.1 组蛋白乙酰转移酶的分类
        1.2.2 p300/CBP
        1.2.3 PCAF
        1.2.4 Gcn5
    1.3 核小体乙酰化酶复合物
        1.3.1 SAGA复合物
        1.3.2 PCAF复合物
    1.4 组蛋白乙酰转移酶功能的研究进展
        1.4.1 组蛋白乙酰转移酶与基因转录调控
        1.4.2 组蛋白乙酰转移酶与细胞周期
        1.4.3 组蛋白乙酰转移酶与疾病
            1.4.3.1 组蛋白乙酰转移酶与癌症
            1.4.3.2 组蛋白乙酚转移酶与神经系统疾病
            1.4.3.3 组蛋白乙酰转移酶与病毒感染
    1.5 腺病毒E1A的研究进展
        1.5.1 E1A的结构及生物学特性
        1.5.2 E1A与p300/CBP、PCAF的关系
        1.5.3 E1A的生物学功能
            1.5.3.1 E1A与细胞周期的关系
            1.5.3.2 E1A与免疫系统的关系
            1.5.3.3 E1A与细胞癌变的关系
    1.6 本文的研究内容及意义
第二章 材料与方法
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 基因
        2.1.2 质粒、菌株
        2.1.3 工具酶和抗体
        2.1.4 人工合成多肽
        2.1.5 试剂
        2.1.6 实验主要仪器
    2.2 方法
        2.2.1 大肠杆菌(E.coli)感受态细胞的制备和DNA转化
            2.2.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
            2.2.1.2 质粒转化感受态细胞
        2.2.2 质粒DNA的提取
        2.2.3 质粒DNA的工具酶处理
            2.2.3.1 DNA的限制性内切酶消化
            2.2.3.2 线性DNA 5’端磷酸基团的去除
            2.2.3.3 粘性末端连接
        2.2.4 DNA的纯化
            2.2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳
            2.2.4.2 DNA片段回收
        2.2.5 PCR相关实验
            2.2.5.1 PCR反应
            2.2.5.2 PCR产物的克隆
            2.2.5.3 定点突变
                2.2.5.3.1 定点突变引物
                2.2.5.3.2 定点突变流程
        2.2.6 重组融合蛋白的表达
        2.2.7 蛋白的分离纯化
            2.2.7.1 蛋白质的分离纯化方法及其原理
            2.2.7.2 菌体细胞超声破碎
            2.2.7.3 亲和层析
            2.2.7.4 阳离子交换层析
            2.2.7.5 凝胶过滤层析
        2.2.8 hPCAF(493-658)蛋白突变体的表达质粒构建、表达和纯化
        2.2.9 SDS-PAGE电泳
            2.2.9.1 分离胶及浓缩胶的制备
            2.2.9.2 SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色
        2.2.10 Western blot检测体外乙酰化反应
        2.2.11 组蛋白乙酰转移酶活性测定
        2.2.12 化学交联反应
        2.2.13 动态光散射实验
        2.2.14 静态激光光散射实验
        2.2.15 pull-down实验
        2.2.16 蛋白质晶体生长
第三章 结果与分析
    3.1 人PCAF组蛋白乙酰转移酶活性区域(HAT)的同源二聚体结构研究
        3.1.1 PCAF(493-658)融合蛋白表达质粒的构建
        3.1.2 PCAF(493-658)蛋白的表达和纯化
        3.1.3 PCAF(493-658)蛋白的晶体筛选、衍射数据收集及解析
        3.1.4 PCAF(493-658)蛋白的整体结构
        3.1.5 溶液中PCAF(493-658)蛋白的二聚化
        3.1.6 PCAF(493-658)蛋白二聚化对其乙酰转移酶活性的影响
        3.1.7 PCAF乙酰转移酶活性的自我抑制
        3.1.8 小结
    3.2 hPCAF HAT和E1A复合体
        3.2.1 腺病毒的E1A片段的表达质粒构建
        3.2.2 PCAF HAT和E1A的相互作用
        3.2.3 E1A对PCAF乙酰转移酶活性的影响
        3.2.4 PCAF HAT和E1A复合体的晶体筛选
        3.2.5 小结
    3.3 p300和E1A复合体
        3.3.1 p300蛋白的表达质粒构建、表达和纯化
        3.3.2 p300与E1A的相互作用
        3.3.3 p300与E1A复合体的纯化
        3.3.4 p300与E1A复合体的晶体初筛
        3.3.5 小结
    3.4 讨论
附录1 图表索引
附录2 缩略语及中英文对照
参考文献
致谢



本文编号：3777314