Caffeine通过A2A受体/SIRT3/AMPK信号通路诱导自噬以缓解氧化应激导致的细胞衰老

发布时间：2023-04-17 05:01

　　细胞衰老和自噬是细胞对应激的两种应答方式，它们之间存在一定的联系。越来越多的证据表明自噬可以调节细胞衰老并且影响细胞的寿命。有研究发现Caffeine在酵母菌和哺乳动物细胞中能诱导自噬，并且Caffeine被报道具有延长酵母菌寿命和缓解细胞衰老的作用。但是目前并不清楚Caffeine缓解细胞衰老的作用是否与其诱导自噬的作用有关。据此，本论文将考察Caffeine缓解细胞衰老的作用与自噬之间的关系，并进一步探讨Caffeine诱导自噬的分子机制。 首先，使用自由基诱导剂AAPH作用于A375细胞诱导细胞发生衰老，建立氧化应激诱导的细胞衰老模型，并在此模型的基础上考察Caffeine缓解细胞衰老的效果。采用MTT法和流式细胞术分别检测细胞的增殖抑制率和ROS生成量及线粒体膜电位，实验结果发现AAPH呈时间浓度依赖性抑制A375细胞增殖，抗氧化剂NAC能缓解AAPH对细胞的增殖抑制作用。结果也显示AAPH呈时间浓度依赖性增加细胞内ROS生成并降低线粒体膜电位。通过衰老相关β-半乳糖苷酶染色、western blotting及激光共聚焦显微技术检测细胞衰老相关的指标，实验结果显示1mM AAP...

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
英文缩略词表
目录
1 前言
    1.1 细胞衰老
        1.1.1 衰老细胞的特点
        1.1.2 导致细胞衰老的因素及细胞衰老的分类
        1.1.3 细胞衰老与组织老化的关系
    1.2 自噬与细胞衰老
        1.2.1 自噬的概述及其生理功能
        1.2.2 自噬与衰老的关系
    1.3 SIRT3
        1.3.1 SIRT3 的概述
        1.3.2 SIRT3 与衰老的关系
        1.3.3 SIRT3 与自噬的关系
    1.4 Caffeine
        1.4.1 Caffeine 的生理作用
        1.4.2 Caffeine 与衰老的关系
        1.4.3 Caffeine 与自噬的关系
    1.5 立体依据
2 Caffeine 缓解 AAPH 诱导的 A375 细胞衰老
    2.1 材料与方法
        2.1.1 主要试剂与材料
        2.1.2 细胞培养
        2.1.3 MTT 法测定细胞增殖抑制率
        2.1.4 ROS 生成量的检测
        2.1.5 线粒体膜电位的检测
        2.1.6 衰老相关的β‐半乳糖苷酶染色
        2.1.7 Western blotting 检测蛋白表达
        2.1.8 激光共聚焦显微镜检测衰老相关异染色质位点及相关蛋白共定位
        2.1.9 数据统计与分析
    2.2 实验结果
        2.2.1 AAPH 抑制 A375 细胞增殖
        2.2.2 AAPH 对细胞内 ROS 生成的影响
        2.2.3 AAPH 对细胞线粒体膜电位的影响
        2.2.4 衰老相关的β‐半乳糖苷酶染色法检测衰老细胞
        2.2.5 AAPH 对 A375 细胞内 p53、p‐p53 和 p21 蛋白表达的影响
        2.2.6 AAPH 诱导了衰老相关异染色质位点的形成
        2.2.7 Caffeine 缓解 AAPH 对 A375 细胞的增殖抑制作用
        2.2.8 Caffeine 减少 AAPH 所致细胞衰老
        2.2.9 Caffeine 减少 AAPH 处理的细胞中的 p53 蛋白磷酸化和 p21 蛋白表达
    2.3 小结与讨论
3 Caffeine 通过诱导自噬缓解氧化应激导致的细胞衰老
    3.1 材料与方法
        3.1.1 主要试剂与材料
        3.1.2 细胞培养
        3.1.3 激光共聚焦显微镜检测自噬小体及相关蛋白共定位
        3.1.4 Western blotting 检测蛋白表达
        3.1.5 透射电子显微镜观察细胞的自噬结构
        3.1.6 线粒体膜电位的检测
        3.1.7 数据统计与分析
    3.2 实验结果
        3.2.1 Caffeine 增加细胞内的自噬小体
        3.2.2 Caffeine 增加了 AAPH 处理的细胞的自噬相关蛋白表达
        3.2.3 透射电子显微镜观察 Caffeine 诱导自噬的情况
        3.2.4 自噬水平提高对 AAPH 处理的细胞中的 p53 磷酸化和 p21 表达的影响
        3.2.5 自噬水平提高对 AAPH 处理的细胞中的线粒体膜电位的影响
    3.3 小结与讨论
4 Caffeine 通过拮抗 A2A 受体而激活 SIRT3/AMPK 信号通路进而诱导自噬
    4.1 材料与方法
        4.1.1 主要试剂与材料
        4.1.2 细胞培养
        4.1.3 Western blotting 检测蛋白表达
        4.1.4 激光共聚焦显微镜检测衰老相关异染色质位点及相关蛋白共定位
        4.1.5 siRNA 转染实验
        4.1.6 数据统计与分析
    4.2 实验结果
        4.2.1 Caffeine 及 A2A 腺苷受体对 AAPH 处理的细胞中 SIRT3 蛋白表达和 AMPK 蛋白磷酸化的影响
        4.2.2 A2A 腺苷受体对 AAPH 处理的细胞中自噬相关蛋白表达的影响
        4.2.3 A2A 受体对 AAPH 处理的细胞中 p53 蛋白磷酸化和 p21 蛋白表达的影响
        4.2.4 Caffeine 及 A2A 受体对 AAPH 处理的细胞中衰老相关异染色质位点形成的影响
        4.2.5 SIRT3 siRNA 转染效率及 SIRT3 沉默对 AMPK 磷酸化的影响
        4.2.6 SIRT3 沉默对自噬相关蛋白表达的影响
        4.2.7 SIRT3 沉默对 p53 磷酸化和 p21 表达的影响
    4.3 小结与讨论
5 结论和展望
    5.1 结论
    5.2 创新和突破
    5.3 展望
参考文献
致谢
在学期间发表论文



本文编号：3792624