布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12与BLS蛋白的融合表达及免疫原性研究

发布时间：2023-08-04 18:36

　　布鲁氏菌病（Brucellosis）是由革兰氏阴性细菌布鲁氏菌属（Brucella）的病原菌感染而引起的一种人畜共患性动物传染疾病。人在感染该病后的主要症状是持续性发热、关节炎、肝脾肿大等，动物感染该病后除上述症状外，在反刍动物中还常造成流产、不孕不育和组织坏死等严重的后果。进入21世纪以来，布鲁氏菌病在我国感染人数和发病率一直处于较高的位置，在畜牧业当中也出现了明显的区域感染回升现象。布鲁氏菌病已经成为严重威胁人类身体健康和阻碍社会经济发展的重要因素之一。目前，布鲁氏菌病在世界范围内尚无彻底治愈的先例，防控布鲁氏菌病疫情的最有效措施依然是通过疫苗接种进行免疫预防。 本文以布鲁氏菌核糖体蛋白基因L7/L12和布鲁氏菌2,4-二氧四氢蝶啶合酶基因bls为研究对象，以猪种布鲁氏菌疫苗S2弱毒活疫苗菌株的全基因组DNA为模板，分别设计克隆引物和融合引物克隆目的基因L7/L12以及L7/L12和bls。将用融合引物克隆得到的L7/L12和bls基因片段利用融合PCR技术进行融合，得到融合基因L7/L12-bls。将L7/L12基因插入到pET-28a质粒载体中，构建成功pET-28a-L7/L...

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 布鲁氏菌概述
        1.1.1 布鲁氏菌的发现历史
        1.1.2 布鲁氏菌的特性及分类
        1.1.3 布鲁氏菌基因组研究概况
        1.1.4 布鲁氏菌的感染机制
        1.1.5 布鲁氏菌的病原学特性
        1.1.6 布鲁氏菌病的传播与流行
        1.1.7 我国布鲁氏菌病疫情及危害
        1.1.8 布鲁氏菌病的防治
    1.2 布鲁氏菌的研究进展
        1.2.1 布鲁氏菌的致病性和调节系统
        1.2.2 布鲁氏菌的免疫原性
        1.2.3 布鲁氏菌的主要外膜抗原
        1.2.4 布鲁氏菌的毒力相关因子
        1.2.5 布鲁氏菌的核糖体蛋白基因（L7/L12）
        1.2.6 布鲁氏菌的 2,4-二氧四氢蝶啶合成酶 BLS
        1.2.7 布鲁氏菌病的诊断方法
    1.3 布鲁氏菌病疫苗的研究进展及研究意义
        1.3.1 畜牧业常用的传统疫苗
        1.3.2 基因工程疫苗的研制与应用
        1.3.3 布鲁氏菌疫苗的研究意义
    1.4 本文的研究内容及研究意义
2 L7/L12 蛋白的制备与鉴定
    2.1 实验材料和实验器材
        2.1.1 试验中用到的基因工程酶类、试剂盒和菌株
        2.1.2 试验中用到主要实验试剂、药品和器材
        2.1.3 本章实验所用试剂及配方
    2.2 试验方法
        2.2.1 引物设计
        2.2.2 目的基因 L7/L12 的 PCR 扩增纯化与双酶切
        2.2.3 pET-28a 质粒载体的提取纯化与双酶切
        2.2.4 目的基因 L7/L12 克隆至 pET-28a 质粒载体
        2.2.5 大肠杆菌克隆菌株 DH5α和表达菌株 TL129 感受态细胞的制备
        2.2.6 重组质粒 pET-28a-L7/L12 转化 DH5α
        2.2.7 大肠杆菌 DH5α阳性克隆子的筛选与测序鉴定
        2.2.8 重组质粒 pET-28a-L7/L12 的提取与双酶切验证
        2.2.9 重组质粒 pET-28a-L7/L12 导入 TL129 菌株及阳性克隆子筛选
        2.2.10 L7/L12 蛋白的诱导表达与鉴定
        2.2.11 L7/L12 蛋白的纯化
    2.3 试验结果
        2.3.1 引物设计结果
        2.3.2 目的基因 L7/L12 的 PCR 扩增结果
        2.3.3 pET-28a 质粒的提取和双酶切结果
        2.3.4 重组质粒 pET-28a-L7/L12 的 DH5α阳性克隆子的菌落 PCR 筛选
        2.3.5 重组质粒 pET-28a-L7/L12 的双酶切检测结果
        2.3.6 重组质粒 pET-28a-L7/L12 碱基序列测定结果
        2.3.7 重组质粒 pET-28a-L7/L12 的 TL129 阳性克隆子的菌落 PCR 筛选
        2.3.8 L7-L12 蛋白的诱导表达与鉴定结果
        2.3.9 L7/L12 蛋白的纯化结果
    2.4 结果和讨论
3 L7/L12-BLS 融合蛋白的制备与鉴定
    3.1 实验材料和实验器材
    3.2 试验方法
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 目的基因 L7/L12 和 bls 的融合片段的 PCR 扩增与纯化
        3.2.3 目的基因 L7/L12 和 bls 的融合 PCR
        3.2.4 融合片段 L7/L2-bls 的纯化与双酶切
        3.2.5 pET-28a 质粒载体的提取纯化与双酶切
        3.2.6 融合片段 L7/L12-bls 克隆至 pET-28a 质粒载体
        3.2.7 重组质粒 pET-28a-L7/L12-bls 转化 DH5α
        3.2.8 大肠杆菌 DH5α-pET-28a-L7/L12-bls 阳性克隆子筛选保存与测序
        3.2.9 重组质粒 pET-28a-L7/L12-bls 的提取与双酶切验证
        3.2.10 重组质粒pET-28a-L7/L12-bls转化TL129表达菌株及阳性克隆子的筛选
        3.2.11 L7/L12-BLS 蛋白的诱导表达与鉴定
        3.2.12 L7/L12-BLS 蛋白的纯化
    3.3 试验结果
        3.3.1 引物设计结果
        3.3.2 L7/L12 和 bls 用融合引物的 PCR 扩增结果
        3.3.3 L7/L12 和 bls 的融合 PCR 及纯化结果
        3.3.4 pET-28a 质粒的提取和双酶切结果
        3.3.5 pET-28a-L7/L12-bls 转化 DH5α阳性克隆子的筛选结果
        3.3.6 重组质粒 pET-28a-L7/L12-bls 的提取及双酶切检测结果
        3.3.7 重组质粒 pET-28a-L7/L12-bls 碱基序列测定结果
        3.3.8 pET-28a-L7/L12-bls 转化 TL129 阳性克隆子筛选结果
        3.3.9 L7/L12-BLS 蛋白的诱导表达及鉴定结果
        3.3.10 L7/L12-BLS 蛋白的纯化结果
    3.4 结果和讨论
4 L7/L12 蛋白和 L7/L12-BLS 融合蛋白的免疫原性研究
    4.1 实验材料和实验器材
        4.1.1 主要试剂配方和实验器材
        4.1.2 实验动物及其处理
    4.2 试验方法
        4.2.1 L7/L12 蛋白和 L7/L12-BLS 融合蛋白免疫长耳家兔
        4.2.2 L7/L12 免疫血清和 L7/L12-BLS 免疫血清以及正常血清的提取
        4.2.3 免疫血清的 Western blot 检测
        4.2.4 免疫血清的 ELISA 检测
    4.3 试验结果
        4.3.1 免疫血清 Western blot 检测结果
        4.3.2 免疫血清 ELISA 检测结果
    4.4 结果及讨论
参考文献
在校研究成果
致谢



本文编号：3838795