构建pTWIN1-EgAgB8/3原核表达系统和抗rEgAgB8/3多抗制备及其诊断价值评估

发布时间：2024-04-25 22:18

　　目的：克隆细粒棘球绦虫AgB8/3(EgAgB8/3)抗原基因编码片段，构建有自切功能的原核表达载体pTWIN1-EgAgB8/3，并进行表达条件的优化和初步纯化，获得较纯的EgAgB8/3重组抗原(rEgAgB8/3)，制备抗rEgAgB8/3抗原的多克隆抗体，通过ELISA-双抗夹心法检测棘球绦虫感染犬粪EgAgB8/3天然抗原并对其诊断价值进行评估。方法：根据Genebank登陆号(AF362442)下载目的基因核酸序列，利用DNAman软件设计引物，以实验室库存的pET32a-EgAgB8/3重组载体为模板，对EgAgB8/3编码分泌型多肽片段的核酸序列进行PCR扩增，构建pEASY-T1-EgAgB8/3重组质粒，经PCR、酶切及测序鉴定后，将EgAgB8/3抗原基因片段定向连入原核表达质粒pTWIN1(+)上，将重组子pTWIN1-EgAgB8/3转化入E.coli DH5α，根据选择标记的氨苄青霉素抗性基因筛选到阳性克隆后将pTWIN1-EgAgB8/3重组质粒转染至大肠杆菌E.coli ER2566，IPTG诱导表达CBD-intein1-EgAgB8/3融合蛋白，通过...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1EgAgB8/3PCR扩增产物

结果表达蛋白3抗原目的基因的克隆基因分泌型多肽片段核酸序列的PCR扩增结果:pET32a-EgAgB8/3模板，P1和P2为引物扩增后8/3DNA片段，与预测片段大小相符(图1)。

图2菌落蓝白斑筛选结果

与预测片段大小相符(图1)。图1EgAgB8/3PCR扩增产物Fig.1PCRproductofEgAgB8/3：DL2000DNAmaker；1~2：PCRprod连接T载体转化后提取质粒pEASY-T1载体相连接转化E.co克隆菌落(如图....

图3pEASY-T1-EgAgB8/30.7%琼脂糖凝胶电泳Fig.3PCRproductweresize-separatedona1%agarosegel

图3pEASY-T1-EgAgB8/30.7%琼脂糖凝胶电泳PCRproductweresize-separatedona1%agarExampleofpEASY-T1-EgAgB8/3gB8/3重组质粒PCR和酶切鉴定试剂盒提取经蓝白斑筛选的阳....

图6pEASY-T1-EgAgB8/3测序图谱

图6pEASY-T1-EgAgB8/3测序图谱Fig.6pEASY-T1-EgAgB8/3sequencingmap1.2.5pEASY-T1-EgAgB8/3重组质粒与pTWIN1空载体双酶切分别用EcoRI和BamHI双酶切质粒pTWIN1....

本文编号：3964320