腹泻患者和生态环境香港海鸥菌的检測及多序列分型研究

发布时间：2016-12-15 19:19

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《南方医科大学》 2015年

腹泻患者和生态环境香港海鸥菌的检測及多序列分型研究

王祉蕴  

【摘要】：研究背景香港海鸥菌(Laribacter hongkongensis, LH)是一种可能致人类严重腹泻的新发现病原菌。该菌2001年首次在香港肝硬化病人的肝和血液中分离到并被鉴定为新种属,随着对该菌研究的进一步深入,除腹泻病人外,香港海鸥菌还在淡水产品中(如草鱼、鳙鱼、虎纹蛙等)及环境水体中被检测出,并被证实进食鱼类和异地旅游是感染香港海鸥菌的危险因素。香港海鸥菌作为一个新发现的病原菌,其可能的源头、不同宿主之间可能存在的关联、造成人类的可能感染方式,不同来源的菌株间的本质差异、遗传多样性、耐药性等问题都亟待解决。目前对LH只能采用基因分型方法进行分型,如PFGE分型、ERIC-PCR分型、MLST分型,冯嘉丽在论文中对LH在广州市售涉淡水产品中分离株进行PFGE和ERIC-PCR分型。香港大学Woo等[3]针对香港淡水鱼及人分离株进行MLST分型。基于分子分型的LH分子特征研究,比表型分型更加精细和稳定,既能用于流行病学调查和疾病爆发的溯源,还能从遗传进化的角度分析LH菌株间的关系。而目前,中国大陆尚缺乏LH阳性株的MLST分型结果及相关研究分析。研究目的1.收集广州市医院门诊腹泻病例的粪便标本进行香港海鸥菌检测并收集相关信息,计算发病率以了解广州地区香港海鸥菌所致腹泻的发病状况,并探索危险因素；2.采集广州市的淡水鱼、食用蛙、食用螺(中华圆田螺、福寿螺)进行香港海鸥菌检测,收集阳性菌株,以了解目前广州市淡水产品中香港海鸥菌的感染情况及各宿主之间联系；3.检测广州市环境水体中香港海鸥菌以探索其携带状况；4.为深入阐明LH的耐药性及分子遗传特征,进行以下研究：分析LH分离株抗生素耐药表型；运用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对不同宿主来源的LH分离株进行分型分析,评价菌株间的遗传亲缘关系。研究方法1.广州市某综合医院门诊腹泻病人粪便标本、广州市农贸市场淡水产品(淡水鱼、食用蛙、福寿螺)及水库水样中香港海鸥菌检出情况的调查研究1.1标本收集和资料获取：2013年5月至2014年11月收集医院感染疾病科门诊,消化科门诊和急诊科胃肠炎腹泻患者的粪便标本；病人的一般情况、临床表现及流行病学资料通过自制的《感染性腹泻调查表》获得；2013年12月至2014年5月选择广州市4家农贸市场,采集淡水产品,包括草鱼、虎纹蛙、中华圆田螺,所采样品单独采集后室温状态即时送实验室检测。在广州市内各区(白云区、天河区、黄浦区、花都区、番禺区、萝岗区)分别选择一个水库(和龙水库、新塘水库、黄埔水库、金钟水库、浑坑水库、新陂水库)共6个水库进行采样,所取水样按无菌原则采集后立即送检。1.2实验室检测：1.2.1香港海鸥菌培养及生化鉴定收集到的腹泻病人标本所采集粪便标本立即放入Cary-blair氏运送培养基,48h内送到实验室进行细菌培养鉴定,粪便标本直接划线改良头孢哌酮酮MacConkey琼脂(CMA)平皿,头孢哌酮浓度为16mg/L, CMA培养皿置37℃恒温培养箱培养48小时,试验均以HKU1菌株(香港大学微生物学系袁国勇教授惠赠)作为阳性对照菌株。可疑细菌进行革兰染色、过氧化氢酶、氧化酶、脲酶和三糖铁等关键生化试验筛选,以上均符合者再采用API鉴定。淡水产品标本在本实验室经相应处理后得到的肠道棉拭子接种LH选择性培养基,及改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)平皿,后检测步骤同上。水库水样采集需在24h内送回实验室进行检测,采用滤膜法进行加压过滤,然后将滤膜置于改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)平皿进行培养,后检测步骤同上。1.2.2香港海鸥菌基因鉴定1.2.2.1特异性片段聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段是香港海鸥菌16S rRNA基因特异性序列,上游序列为：5'-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3',下游序列为：5'-TCTCTTCGAGGTTCGGTA-3',扩增片段大小为550bp。反应体系：总体积：50μL,其中10xPCR缓冲液25mmol/L MgC12 4μL,2.5 mmol/L dNTPs 4μL,5U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL,0.6mmol/L引物各1μL,模版DNA 5μL,双蒸水29.75μL。反应条件为94.0℃ 5min,94.0℃ 30S,53.0℃ 40S,72.0℃ 40S,35个循环,72.0℃ 5min。用DL2000作为PCR扩增产物的Marker,以LH人源株(HKUI,香港大学医学院微生物学系袁国勇教授惠赠)为阳性对照,以大肠杆菌ATCC25922为阴性对照。1.2.2.3 16S rRNA PCR扩增与测序方法同上,引物设计参照文献[1],扩增16S rRNA基因序列,序列为：LPW264:5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', LPW265: 5'-GNTACCTTGTTACGACTT-3',长度为1495bp。PCR扩增产物送华大基因公司进行序列测定。2.纸片扩散法确定LH人源分离株的抗生素敏感性采用WHO推荐的K-B纸片扩散法测,判定标准按美国CLSI/NCCLSM100-519抗微生物药物敏感性试验执行标准(2009版)肠杆菌科抑制圈直径的解释标准执行。敏感(susceptible,s)率、中介(intermediate,I)率、耐药(resistant,R)率分别用S%、I%、R%表示。并用大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923作质控。3.香港海鸥菌分离株的MLST分型选择本实验室保存的采集自广州市、江门市的香港海鸥菌分离株,提取DNA并纯化,采用港大的香港海鸥菌MLST方案,即选择rho、acnB、trpE、ftsH、 thiC、ilvC、eno等7个基因位点进行PCR扩增,扩增产物送华大基因进行正反测序后,进行拼接,得到等位基因序列,将其提交港大进行比对分析,获得相应的等位基因编号及根据等位基因谱得出的ST型号。采用eBURST、START2、 mega6等软件对等位基因编号、ST型号、核苷酸序列进行分析。研究结果1.广州市人群现场LH研究于2013年5月-2014年11月采集广州市某综合医院门诊腹泻患者545例(编号：1004-1548)粪便进行香港海鸥菌的检测,目前未发现香港海鸥菌感染阳性病例。2.广州市部分淡水产品LH检测结果324份淡水产品中共检出香港海鸥菌53株,阳性率为16.36%(53/324),其中草鱼256份,香港海鸥菌在草鱼的阳性率为17.97%(46/256),15只虎纹蛙中检出7只阳性,阳性率为46.67%。中华圆田螺53份,未检出LH。3.广州市各区水库水样LH检测结果于白云区和龙水库的水样培养分离出香港海鸥菌,经过生化鉴定及16SrRNA基因序列测定,,并与GenBank中登录的香港海鸥菌(菌株号HKUI)进行序列比对,其同源性均为99%,这是目前广东省广州市水库中首次发现香港海鸥菌。水库分离株菌落形态：CMA培养基37℃培养48h后,菌落呈灰白色、半透明、圆形、略凸起、直径在1.0一1.5mm之间、光滑、不粘连,略显湿润,革兰氏染色镜检为革兰氏阴性,形状呈螺旋杆状或展翅海鸥形状。水库分离株的生化检测结果：均为革兰氏阴性菌,氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、精氨酸双水解酶、硝酸盐还原酶、甘露醇、葡糖酸盐、癸酸盐等阳性,三糖铁、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、硫化氢、吲哚、3-羟基丁酮、明胶酶、p一半乳糖苷酶、纤维糖、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、葡萄糖等阴性。4.广州市分离株药敏结果54株LH分离株对10个种类常用抗生素中的19种药物均表现不同程度的耐药性。耐药率从高到低依次如下：头孢哌酮(53/54,98.15%),头孢唑啉(52/54,96.30%),头孢噻吩(51/54,94.44%),氨苄西林(44/54,81.48%),利福平(38/54,70.37%),红霉素(15/54,27.78%),哌拉西林(11/54,20.37%),四环素(10/54,18.52%),头孢他啶(8/54,14.81%),环丙沙星(7/54,12.96%),头孢吡肟(6/54,11.11%),氨曲南(5/54,9.26%),链霉素(4/54,7.41%),头孢呋辛(4/54,7.41%),复方新诺明(3/54,5.56%),氯霉素(2/54,3.70%),亚胺培南(1/54,1.85%),阿米卡星(1/54,1.85%),庆大霉素(0/54,0%)。各种分离株均发现对头孢菌素类抗生素表现耐药,大多数对第一、三代头孢菌素表现耐药,而对第二、四代头孢菌素表现较低的耐药性。大多数分离株对利福平表现耐药。5.LH分离株MLST分型结果5.1 ST型分布结果ST型分布：本研究LH分离株共分为72个ST型,3株人源分离株中,产生3个ST型,其中一个为已发现ST型,另外两个ST型为新发现型号；55株鱼分离株中,产生23个基因型,其中,其中有21个新发现型号,其余2个已发现型为ST42、ST45；4株福寿螺分离株,产生4个基因型,均为新型；51株蛙源分离株,产生42个基因型,出现36个新ST型。本次研究的香港海鸥菌分离株中,ST45型出现频率最高,共28个LH分离株,其中仅有鱼来源分离株,地点分布于广州市与江门市。其次为ST117,共4个LH分离株,且全部属于蛙来源分离株,采样地点均在广州市。再次,ST42、ST23、 ST106均有3个LH分离株。ST101在江门市腹泻患者来源LH分离株JM-623与广州市野生虎纹蛙来源LH分离株GZ-W59中均出现,提示其可能的传播途径。5.2 eBURST软件进一步分析结果运用eBURST软件对等位基因号及ST型号进行分析,可以将所有ST型分成10组克隆复合体,第一组(group 1) ST45为预测基础型(概率为83%)。第二组(group2)包括ST42、ST156、ST143 (ST42为预测基础型)；第三组(group3)包括ST128、ST137;第四组(group4)包括ST123、ST122;第五组(group5)包括ST119、ST150;第六组(group6)包括ST117、ST159;第七组(group7)包括ST112、ST160;第八组(group8)包括ST102、ST135;第九组(group9)包括ST101、ST27;第十组(group10)包括ST23、ST149。5.3 START2软件进一步分析结果5.3.17个管家基因基因成分及多态位点分析对于香港海鸥菌的各分离株中所选7个管家基因的等位基因进行碱基组成分析,各管家基因之间与分离株之间的平均G+C%含量差异不大,提示未出现从外源的细菌或其他物种的基因水平转移现象。对rho、trpE、ilvC、thiC、eno,其dN/dS值0.05(平均值：0.0221,0.0000-0.0417), acnB、ftsH的dN/dS值1。5.3.27个管家基因基因重组测试结果rho、thiC等2个管家基因对应SSCF P值与SSUF P值均0.05,其余5个管家基因acnB、ftsH、trpE、ilvC、eno等的SSCF P值与SSUF P值均0.05,二值提示结论一致,增加了thiC基因重组的可信度。5.3.3 7个管家基因的连锁不平衡分析鱼来源LH分离株、蛙来源LH分离株及螺来源LH分离株中的等位基因均存在连锁不平衡现象,表明LH分离株不同管家基因之间相互不独立。而且鱼来源分离株ISA最大,其次是螺来源分离株ISA,最后是蛙来源分离株ISA。人源分离株(3株)的等位基因显示连锁平衡,但由于其菌株数目有限,结果可靠性值得考究。对于所有分离株进行连锁不平衡分析：方法1 (Haubold):ISA =0.583(P=0.000);方法2 (Maynard Smith):ISA=3.4978(P=0.000)。两种方法的结果一致显示,所有分离株的等位基因存在连锁不平衡现象,表明LH分离株不同基因座之间相互不独立。5.3.4所有香港海鸥菌分离株聚类分析广州市内首次检出的水库株GZ-SHUI (ST151型)与广州市内多株鱼来源分离株及蛙来源分离株有较近的亲缘关系。作为新发现的江门市来源的福寿螺分离株,其中JM-L16与JM-L143亲缘关系很近,JM-L10与其的亲缘关系仅次之,JM-L2的亲缘关系相对较远,追溯采样地点,发现JM-L143采自东郊鱼塘,而其余3株则采自西郊稻田。人源分离株HZ242. JM-623. JM-679的ST型分别为ST100、ST101、ST63,其中ST63在香港也有检出,为鱼源分离株,ST100、ST101为新型,HZ242的亲缘关系与广州2株蛙源分离株GZ-W334、GZ-W338相近,JM-623与广州1株蛙源分离株GZ-W59的ST型一致。广州市来源香港海鸥菌分离株与江门市来源香港海鸥菌分离株存在很多相同ST型,如ST45、ST42、ST106、ST101等,其中ST45及ST42型均在香港有检出过,且为优势ST型。研究结论1.本次研究对广州市某综合医院545例门诊腹泻患者粪便进行香港海鸥菌的检测,目前未发现香港海鸥菌感染阳性病例。324份淡水产品中共检出香港海鸥菌53株,其中香港海鸥菌在草鱼的阳性率为17.97%,虎纹蛙中阳性率为46.67%。中华圆田螺中未检出。本研究在广州市水库水样中分离出香港海鸥菌,证明了在天然水环境中存在香港海鸥菌。因此,携带香港海鸥菌的水库水可能为香港海鸥菌的感染渠道。同时,水库是淡水鱼类等淡水产品的常见生活环境,因而作为香港海鸥菌传播途径的环境媒介,对香港海鸥菌的流行具有重要意义。2.各种分离株均发现对头孢菌素类抗生素表现耐药,大多数对第一、三代头孢菌素表现耐药,而对第二、四代头孢菌素表现较低的耐药性。大多数分离株对利福平表现耐药。大多数分离株对亚胺培南、庆大霉素、阿米卡星等药物较敏感。3.本研究所采用的MLST研究方案为选取rho、ancB、ftsH、trpE、ilvC、 thiC、eno等7个管家基因,7个管家基因的多态位点总数目为298个。本次研究针对7个管家基因进行基因重组分析,提示rho、thiC等2个管家基因可能存在基因内基因重组现象；同时其余5个管家基因acnB、ftsH、trpE、ilvC、eno等未存在基因内基因重组现象。该次研究针对各管家基因进行连锁不平衡分析,结果显示等位基因均存在连锁不平衡现象,表明LH分离株不同管家基因之间相互不独立。本次对香港海鸥菌进行MLST分型,LH分离株采自广州市与江门市,选取人源、鱼源、蛙源、螺源、水库来源香港海鸥菌菌株进行研究。研究结果显示共检出63个新ST型(ST99-ST161),说明菌株异质性较高,同时对香港海鸥菌MLST数据库进行了补充,可供其他实验室进行数据分享及比较。广州市内检出的水库株GZ-SHUI (ST151型)与广州市内多株鱼来源分离株及蛙来源分离株有较近的亲缘关系,可能有共同的遗传祖先。提示水库水与鱼、蛙同时作为海鸥形菌的储存宿主,可能其间存在传播环。作为新发现的江门市来源的福寿螺分离株,产生4个ST型,均为新型,其亲缘关系与采样地点无关。人源分离株HZ242的亲缘关系与广州2株蛙源分离株相近,人源分离株JM-623与广州1株蛙源分离株ST型一致。该结果提示人感染香港海鸥菌可能与进食未煮熟的鱼、蛙等导致。LH的某些ST型存在地域较广,且出现频率较高,可以为今后的优势流行株的预测提供科学依据,也可对这若干种优势ST型对应菌株进行进一步的分析研究其毒力、致病性以及耐药性的相关特征,为今后的防治策略的制定提供基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574.62;R446.5
【目录】：

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10 任涛;廖明;曹伟胜;辛朝安;;鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株膜蛋白基因的克隆及序列分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 余志平;[N];中国医药报;2006年

中国博士学位论文全文数据库 前7条

1 徐爱强;新型人类肠道病毒山东分离株的分子流行病学及其基因组特征研究[D];山东大学;2012年

2 王晶钰;鸡肾型传染性支气管炎病毒陕西分离株N、M和S1基因的分子遗传变异研究[D];西北农林科技大学;2006年

3 付宝权;旋毛虫分子鉴定研究与半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的克隆、表达及初步鉴定[D];中国农业科学院;2012年

4 段旭基;基因Ⅸ型新城疫病毒病原学监测与不同禽源分离株毒力和遗传进化研究[D];西北农林科技大学;2013年

5 梁俊文;新城疫分离株P和HN基因分子进化与致病性的相关研究[D];山东师范大学;2010年

6 蒋贻海;传染性支气管炎致腺胃病变毒株变异的分子基础及我国和东南亚分离株的分子流行病学研究[D];南京农业大学;2002年

7 陈燕芬;布鲁氏菌中国分离株遗传多态性研究[D];吉林大学;2012年

  本文关键词：腹泻患者和生态环境香港海鸥菌的检測及多序列分型研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：214257