背景介绍:MG53(Mitsugumin53)是一种横纹肌特异性表达的TRIM/RBCC家族蛋白,别名为TRIM72。TRIM/RBCC家族成员蛋白在其氨基的末端具有三个高度保守的结构域,分别称为环指结构,锌指结构(B-box)和螺旋结构。MG53特异性的在横纹肌(心肌细胞,骨骼肌细胞)中表达,它主要是以囊泡的形式包吐并定位于细胞膜之下,并且在细胞膜的损伤修复中起重要的作用。在心肌细胞和骨骼肌细胞中,通过转染腺病毒使细胞过表达MG53,发现MG53过表达能增强囊泡转运,出芽和包吐作用。然后在MG53敲除小鼠中发现,通过将MG53敲除后,基因敲除鼠表现出肌营养不良,而细胞膜的修复功能缺失与肌营养不良有紧密的关联。在细胞膜受到损伤时,MG53通过感受胞内氧化环境的变化,能够触发富含MG53的囊泡富集到细胞膜损失的部位。此外,MG53可以通过与dysferlin,caveolin-3的相互作用,从而增强囊泡的出芽和转运,并对细胞膜进行修复。表明MG53这一心脏特异性表达基因在心电稳定性维持中起重要作用。同样,这些表型也可能是与细胞膜的修复功能缺失有紧密的关联。最近有报道发现,在心肌缺血再灌注损伤中,MG53介导损伤细胞膜修复作用从而对心肌起保护作用,并且在缺血预适应中起重要的保护作用。心肌的缺血进而会导致心肌缺氧,从而会发生一连串的病理生理反应,例如细胞出现钙超载,同时细胞膜的损伤会导致离子通道的重构,从而导致心律失常。MG53已被证实在缺血预适应中起重要的保护作用。但与此同时有文献表明,过表达MG53将引起糖尿病心肌病。然而MG53对心肌细胞细胞钙信号的调控作用以及对其是否影响离子通道重构还罕见报道。方法与结果:本研究以原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞/SD成年大鼠心肌细胞/MG53敲除鼠为模型,通过利用腺病毒载体的技术使细胞内过表达/敲低表达MG53,来观察在正常生理条件下,MG53对心肌细胞钙信号的调节以及动作重构的影响。我们研究发现超表达MG53能使得心肌细胞钙火花的发放频率增高,并且我们发现过表达MG53会使得动作电位时程显著减短。MG53敲低时心肌细胞钙火花的发放频率显著减少,动作电位时程显著延长。Ik1电流密度显著降低。同样我们发现相比于对照组,MG53基因敲除小鼠动作电位显著延长,IKs1和IKs2电流密度显著降低。结论:双向调控MG53都会显著影响钙火花的发生,但调节MG53的表达并未引起其他钙信号指标的改变,因此我们推测MG53通过增加肌浆网钙库的Ry R的活性从而降低了管腔内诱导零星的钙火花Ca2+水平阈值。于此同时我们发现调节MG53表达会引起动作电位重构,因此可作为临床上治疗心律失常疾病提供一个新的靶点。
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54
文章目录
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 MG53背景介绍
1.2 心肌钙信号转导系统
1.2.1. 质膜钙通道
1.2.2. RyR受体
1.2.3. 肌浆网的钙泵（SERCA）
1.2.4. 质膜上的钠钙交换系统（Na-Ca Exchanger, NCX）
1.3 钾离子通道
第2章 正文
2.1 材料
2.1.1. 主要仪器与设备
2.1.2. 主要试剂
2.1.3. 实验动物
2.2 方法
2.2.1. 乳鼠心肌细胞培养
2.2.2. 成年大鼠心肌细胞分离与培养
2.2.3. 蛋白样品的制备
2.2.4. 蛋白质浓度测定
2.2.5. 蛋白质印记
2.2.6. 病毒扩增
2.2.7. 病毒纯化
2.2.8. 病毒滴度测定
2.2.9. 钙荧光探针的装载
2.2.10. 共聚焦显微镜扫描参数设定
2.2.11. 钙瞬变以及钙火花数据的处理
2.2.12. 场电位刺激
2.2.13. 局部灌流给药
2.2.14. 膜片钳微电极制作
2.2.15. 玻璃电极的拉制
2.2.16. 热抛光
2.2.17. 电极液的充灌
2.2.18. 千兆欧姆封接
2.2.19. 电容补偿
2.2.20. 膜电流与膜电容记录
2.2.21. 记录细胞膜电容
2.2.22. 记录L型钙电流
2.2.23. 记录动作电位
2.2.24. 记录钾电流
2.3 结果
2.3.1. 腺病毒转染后MG53蛋白在心肌细胞中表达量的比较
2.3.2. MG53对乳鼠心肌细胞钙瞬变的影响
2.3.3. MG53蛋白对乳鼠心肌细胞肌浆网钙库容量以及内钙清除系统的影响
2.3.4. MG53对心肌钙火花的影响
2.3.5. MG53对大鼠乳鼠心肌细胞L型钙通道的调节作用
2.3.6. MG53对大鼠乳鼠心肌细胞动作电位的调节作用
2.3.7. MG53敲除对小鼠动作电位的影响
2.3.8. MG53敲除对小鼠Iks1和Iks2通道的影响
2.3.9. MG53对成年大鼠Ik通道的影响
2.3.10. MG53对成年大鼠Ik1通道的影响
2.4 结论
2.5 讨论
2.6 基金资助
参考文献
致谢
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