熊果酸滴眼液抑制缝线诱导大鼠角膜新生血管的实验研究

发布时间：2016-12-23 06:27

  本文关键词：熊果酸滴眼液抑制缝线诱导大鼠角膜新生血管的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

《南方医科大学》 2014年

熊果酸滴眼液抑制缝线诱导大鼠角膜新生血管的实验研究

曾丽娜  

【摘要】：[研究背景] 正常角膜在多种因素共同作用下处于稳定的“免疫赦免”状态,以保持角膜的透明性,使角膜能够发挥正常的生理功能。在某些因素作用下,如配戴角膜接触镜、感染、眼外伤、热烧伤或化学伤、既往手术史、免疫性眼病等可使角膜的“免疫赦免”平衡被打破导致角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的产生。虽然角膜新生血管对清除感染、促进伤口愈合、抑制角膜溶解等有一定作用,但角膜新生血管可破坏角膜正常微环境,使眼前节相关免疫赦免偏离消失,使角膜失去透明性,严重影响视力甚至导致失明。角膜新生血管的发病机制尚不明确,目前研究发现新生血管的发生与促血管生成因子及抗血管生成因子的失衡、角膜缘血管屏障破坏、缺氧、炎症反应、角膜水肿等多种因素的参与有关。 目前对于角膜新生血管的治疗原则主要有抑制血管生成和促进血管退化,具体有：药物治疗如激素、非甾体类抗炎药、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂等；手术治疗如眼表重建术、电解针烧灼法等；基因治疗如内皮抑素(ES)、色素上皮衍生因子(PEDF)、血管生成抑素(AS)等；其他治疗如激光治疗,光动力学疗法等。随着角膜新生血管发病机制的深入研究,其治疗方法也取得很大的进展,但目前临床上尚无治疗角膜新生血管的理想药物。因此,寻找作用强、副作用少、价格经济、更为有效的新生血管抑制剂仍然是角膜新生血管研究的热点。 熊果酸(ursolic acid, UA)又名乌苏酸、乌索酸,是一种存在于多种天然植物中的三萜类化合物,具有抗炎、抗菌、抗糖尿病、降低血糖、抗癌、抗促癌等多种生物学效应。近年来对熊果酸的研究发现,它具有抗多种恶性肿瘤血管生成的作用,不但能抑制肿瘤细胞生长,而且还能抑制肿瘤新生血管的形成。熊果酸能够抑制血管生成的作用,主要有：①抑制血管内皮细胞(VEC)的增殖、迁移和管腔形成；②具有抗炎作用,能够抑制环氧化酶Ⅱ(Cyclooxygenase-2,COX-2)的表达,减轻炎症反应；③降低VEGF的表达,从而抑制血管内皮细胞的增殖、移行；④刺激基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP-2)和尿激酶,达到降解细胞外基质,促进细胞凋亡,抑制新生血管腔形成的目的。 VEGF是一种具有生物学效应的血管源性肽,是目前研究最多的血管生成因子之一,是一个强有力的内源性血管生长刺激因子,它能够调节造血干细胞的发育、细胞外基质的转型和炎性因子的产生,是一个特异作用于血管内皮细胞的生长因子,能够直接刺激血管内皮细胞的增生并诱导新生血管的生成。研究证明VEGF参与新生血管生成的多个步骤,是影响新生血管生成最重要的因子之一。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组活性依赖金属离子锌并以细胞外基质成分为水解底物的结构和功能复杂的蛋白酶家族,主要参与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的水解和重构。基质金属蛋白酶-2,又叫明胶酶A,是目前研究最多的MMPs之一,在细胞外基质合成和降解代谢过程中发挥着重要的作用,参与新生血管形成。实验表明,VEGF能够通过多种细胞因子途径作用于血管内皮细胞,刺激细胞外基质的降解,诱导内皮细胞增殖、迁徙、分化和官腔形成作用。体外实验也表明,熊果酸能够抑制血管内皮细胞的迁移,上调尿激酶和MMP-2的表达,抑制内皮细胞的管腔形成。 目前熊果酸用于角膜新生血管的研究尚无相关的报道,因此,我们的实验通过观察熊果酸的角膜毒性作用,筛选安全浓度范围内的熊果酸滴眼液,观察其抑制角膜新生血管的作用及VEGF、MMP-2在角膜新生血管中表达的影响,初步探讨其可能的机制。 第一部分熊果酸滴眼液对大鼠角膜毒性作用的实验研究 [目的] 研究熊果酸滴眼液对大鼠角膜的毒性,寻找熊果酸滴眼液局部使用的安全浓度。 [方法] 在无菌条件下将熊果酸溶于含有二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)助溶剂的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)中,分别制成2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml的熊果酸滴眼液。SPF级雌性SD大鼠48只,随机分为PBS滴眼液组、含DMSO助溶剂的PBS滴眼液组、2mg/mlUA组、4mg/mlUA组、6mg/mlUA组、8mg/mlUA组,共6组。各组大鼠均左眼用药,4/日,共7d。每日对大鼠角膜行裂隙灯显微镜检查并临床分级,7d后摘取角膜行组织学检查。 [结果] PBS组、含DMSO的PBS组、2mg/ml、4mg/ml、6mg/mlUA组裂隙灯显微镜检查角膜均未见异常,临床分级为0级,组织学光镜检查未见明显异常；8mg/mlUA组第5日裂隙灯显微镜下见角膜轻度水肿,临床分级为1级,继续用药未见损害加重,组织学检查见角膜上皮层未见表层细胞缺失,上皮层增厚,排列较紊乱,基底层细胞排列紊乱,其余各层未见明显异常。 [结论] 2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml熊果酸滴眼液对大鼠角膜无明显毒性作用。 第二部分熊果酸滴眼液对大鼠角膜新生血管的抑制作用及机制的研究 [目的] 研究熊果酸滴眼液对大鼠角膜新生血管的抑制作用及VEGF、MMP-2在角膜新生血管中表达的影响,探讨其初步的机制。 [方法] 随机抽取SD大鼠5只,作为正常对照组,其余50只大鼠建立缝线诱导角膜新生血管模型(左眼),随机分为A组：含DMSO的PBS滴眼液(PBS-D组),B组：2mg/mlUA滴眼液,C组：4mg/mlUA滴眼液,D组：6mg/mlUA滴眼液,E组：0.1%地塞米松磷酸钠滴眼液。每组10只,术后第1天开始用药,4/日。第一周每日对大鼠角膜行裂隙灯显微镜检查,第二周每两天观察一次。术后第4、7、14天,在裂隙灯下测量角膜新生血管长度,计算角膜新生血管面积。术后4、7、14天切取角膜行组织学检查,并采用免疫组织化学染色法检测VEGF以及MMP-2的表达。 [结果] 大鼠角膜术后4天,A组CNV面积为(8.11±0.89)mm2、B组为(4.98±1.20)mm2、C组为(2.18±1.08)mm2、D组为(0±0)mm2、E组为(0±0)mm2；术后7天,A组CNV面积为(25.00±1.75)mm2、B组为(19.97±1.47)mm2、C组为(15.63±1.57)mm2、D组为(11.35±1.39)mm2、E组为(11.97±1.13)mm2；术后14天,A组CNV面积为(38.00±0.36)mm2、B组为(36.74±0.73)mm2、C组为(27.15±1.14)mm2、D组为(20.83±0.60)mm2、E组为(21.40±0.68)mm2。 角膜CNV面积的统计学分析：①从各个时间点看,A组CNV面积显著高于其余四组(P0.05),差异有统计学意义；②B、C、D组CNV面积的两两比较：在第4、7、14天,差异均有统计学意义(P0.05),故三种不同浓度的UA滴眼液能够显著抑制大鼠CNV的生长,随着浓度的增加,抑制能力增强,呈浓度依赖性；③B、C组与E组相比,在第4、7、14天,CNV面积均高于E组,差异有统计学意义(P0.05)；D组与E组相比,在4、7、14天,CNV面积差异无统计学意义(P0.05)。 角膜组织切片检查结果：A组第4天角膜上皮层局部增生,基质层可见新生血管,新生血管周围有炎性细胞浸润；7、14天,角膜增厚,上皮层有炎性细胞浸润,基质层有大量新生血管形成,官腔较大,伴有炎性细胞浸润,内皮未见新生血管。B组第4天角膜上皮层有炎性细胞浸润,靠近上皮层的基质层有新生血管形成,周围有炎性细胞浸润；7、14天,角膜增厚,上皮层紊乱,有炎症细胞浸润,基质层有大量新生血管,主要在中上部居多,新生血管周围可见较多炎症细胞浸润,内皮未见新生血管。C组第4天角膜上皮层有炎症细胞浸润,基质层偶见新生血管形成,新生血管周围伴有炎性细胞浸润；7、14天,角膜稍增厚,上皮层有炎性细胞浸润,基质层可见新生血管形成,新生血管周围有炎性细胞浸润,内皮层未见新生血管。D、E组第4天角膜上皮完整,未见新生血管结构；7、14天,角膜上皮完整,基质层可见少许的新生血管,新生血管周边有少许炎性细胞浸润,内皮层未见新生血管。 免疫组化染色结果：正常角膜上皮和基底膜少量表达VEGF和MMP-2；A、B、C组-在第4d,角膜全层表达VEGF,第7d表达增强,第14d表达明显减弱；D、E组-第4d角膜的缝线处、上皮层、基质层出现VEGF、MMP-2的表达,第7天表达增强,角膜全层均有表达,主要在上皮层和新生血管附近,第14天表达减弱。 VEGF、MMP-2统计学分析结果：①各个时间点看,A组VEGF、MMP-2的COD值显著高于B、C、D、E组(P0.05),差异有统计学意义。②B、C、D组的COD值两两比较,差异有统计学意义(P0.05)；③B、C组在各个时间点的COD值均高于E组,差异有统计学意义(P0.05)；D组与E组相比,在各个时间点上的COD值差异均无统计学意义(P0.05)。 [结论] 熊果酸滴眼液可以有效的抑制缝线诱导角膜新生血管的生长,随着浓度的增加,抑制新生血管作用增强,并呈浓度依赖性。熊果酸通过降低VEGF、MMP-2的表达起到抑制角膜新生血管生长的作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R779.65
【目录】：

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本文编号：224370