角膜保存过程中角膜内皮细胞发生自噬的作用及机制研究
发布时间：2023-05-13 20:14
目的:探讨在角膜中期保存过程中角膜内皮细胞发生自噬的作用及内在机制。方法:用Optisol保存大鼠角膜,建立角膜中期保存的模型。茜素红染色观察角膜内皮细胞数目、形态,免疫荧光染色检测内皮细胞结构及功能相关标志物ZO-1、F-actin、N-cadherin及Na+-K+-ATPase的表达变化,扫描电镜观察内皮细胞超微结构的改变;蛋白质印迹和免疫荧光染色检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1、SQSTM1/P62表达的改变;TUNEL染色和免疫荧光染色检测活化的caspase3观察细胞凋亡的情况;我们还进行了大鼠的角膜移植,并研究了自噬激动剂或抑制剂(雷帕霉素或氯喹)的作用。结果:在角膜保存过程中,随时间延长,角膜内皮细胞数量逐渐减少,出现形态改变,细胞核皱缩,细胞连接ZO-1不完整、细胞骨架F-actin、细胞表面黏附分子N-cadherin破坏,Na+-K+-ATPase异常表达。扫描电镜显示角膜内皮细胞间连接断裂,细胞水肿,表面微绒毛消失。同时,免疫荧光和免疫印迹等检测方法显示LC3Ⅱ及Beclin1的表达随时间延长先增后减,15d达峰值;SQSTM1/P62变化趋势与之相反。...
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 角膜内皮细胞
1.1.1 角膜内皮细胞的形态特征
1.1.2 角膜内皮细胞的功能
1.2 角膜保存
1.2.1 角膜保存的发展
1.2.2 角膜保存的方法
1.2.3 角膜保存的展望
1.3 自噬
1.3.1 自噬概述
1.3.2 自噬的研究方法
1.3.3 自噬的双重作用
1.4 角膜疾病中的自噬
1.4.1 角膜内皮营养不良
1.4.2 角膜相关微生物感染
1.4.3 圆锥角膜
1.4.4 Schnyder角膜营养不良(SCD)
第二章 实验材料
2.1 实验动物
2.2 主要抗体
2.3 主要实验试剂及耗材
2.4 主要试验仪器
2.5 主要试验溶液的配制
2.5.1 Whole mount免疫荧光染色相关试剂的配制
2.5.2 茜素红染色相关试剂的配制
2.5.3 Western blot相关溶液配制
2.5.4 TUNEL染色相关试剂的配制
2.5.5 扫描电子显微镜相关试剂的配制
2.5.6 自噬抑制剂、激活剂等相关溶液的配制
2.6. 主要应用软件
第三章 实验方法
3.1 相关模型的建立与观察
3.1.1 大鼠角膜保存模型的建立
3.1.2 保存后的观察
3.1.3 大鼠角膜移植模型的建立
3.2 茜素红染色
3.3 全角膜片Whole mount免疫荧光染色
3.4 扫描电镜
3.4.1 取材和固定
3.4.2 脱水
3.4.3 冷冻干燥与喷金
3.4.4 扫描电镜观察
3.5 TUNEL染色
3.5.1 全角膜片的TUNEL染色
3.6 Western blot免疫印迹分析
3.6.1 组织蛋白的提取
3.6.2 蛋白样品的定置与制备
3.6.3 SDS-PAGE凝胶的制备
3.6.4 SDS-PAGE电泳
3.6.5 转膜
3.6.6 免疫反应与显影
3.7 统计学分析
第四章 结果
4.1 角膜保存过程中内皮细胞的改变
4.1.1 角膜保存过程中内皮细胞数量、形态及功能的改变
4.1.2 角膜保存过程中内皮细胞超微结构的改变
4.2 角膜保存过程中内皮细胞的自噬
4.3 角膜保存过程中内皮细胞的凋亡
4.4 自噬调控剂对角膜保存中内皮细胞的影响
4.4.1 自噬调控剂调节角膜保存中内皮细胞的自噬
4.4.2 自噬对角膜保存中内皮细胞的凋亡的影响
4.4.3 自噬对角膜保存中内皮细胞的活性的影响
4.4.4 大鼠角膜移植后的角膜状态
第五章 讨论
5.1 角膜保存过程可诱导角膜内皮细胞发生自噬
5.2 自噬对角膜内皮细胞的保护作用
5.3 自噬在角膜内皮疾病中的潜在应用价值
第六章 结论
附录 中英文对照表
参考文献
致谢
本文编号：3816443
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 角膜内皮细胞
1.1.1 角膜内皮细胞的形态特征
1.1.2 角膜内皮细胞的功能
1.2 角膜保存
1.2.1 角膜保存的发展
1.2.2 角膜保存的方法
1.2.3 角膜保存的展望
1.3 自噬
1.3.1 自噬概述
1.3.2 自噬的研究方法
1.3.3 自噬的双重作用
1.4 角膜疾病中的自噬
1.4.1 角膜内皮营养不良
1.4.2 角膜相关微生物感染
1.4.3 圆锥角膜
1.4.4 Schnyder角膜营养不良(SCD)
第二章 实验材料
2.1 实验动物
2.2 主要抗体
2.3 主要实验试剂及耗材
2.4 主要试验仪器
2.5 主要试验溶液的配制
2.5.1 Whole mount免疫荧光染色相关试剂的配制
2.5.2 茜素红染色相关试剂的配制
2.5.3 Western blot相关溶液配制
2.5.4 TUNEL染色相关试剂的配制
2.5.5 扫描电子显微镜相关试剂的配制
2.5.6 自噬抑制剂、激活剂等相关溶液的配制
2.6. 主要应用软件
第三章 实验方法
3.1 相关模型的建立与观察
3.1.1 大鼠角膜保存模型的建立
3.1.2 保存后的观察
3.1.3 大鼠角膜移植模型的建立
3.2 茜素红染色
3.3 全角膜片Whole mount免疫荧光染色
3.4 扫描电镜
3.4.1 取材和固定
3.4.2 脱水
3.4.3 冷冻干燥与喷金
3.4.4 扫描电镜观察
3.5 TUNEL染色
3.5.1 全角膜片的TUNEL染色
3.6 Western blot免疫印迹分析
3.6.1 组织蛋白的提取
3.6.2 蛋白样品的定置与制备
3.6.3 SDS-PAGE凝胶的制备
3.6.4 SDS-PAGE电泳
3.6.5 转膜
3.6.6 免疫反应与显影
3.7 统计学分析
第四章 结果
4.1 角膜保存过程中内皮细胞的改变
4.1.1 角膜保存过程中内皮细胞数量、形态及功能的改变
4.1.2 角膜保存过程中内皮细胞超微结构的改变
4.2 角膜保存过程中内皮细胞的自噬
4.3 角膜保存过程中内皮细胞的凋亡
4.4 自噬调控剂对角膜保存中内皮细胞的影响
4.4.1 自噬调控剂调节角膜保存中内皮细胞的自噬
4.4.2 自噬对角膜保存中内皮细胞的凋亡的影响
4.4.3 自噬对角膜保存中内皮细胞的活性的影响
4.4.4 大鼠角膜移植后的角膜状态
第五章 讨论
5.1 角膜保存过程可诱导角膜内皮细胞发生自噬
5.2 自噬对角膜内皮细胞的保护作用
5.3 自噬在角膜内皮疾病中的潜在应用价值
第六章 结论
附录 中英文对照表
参考文献
致谢
本文编号：3816443
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yank/3816443.html
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