AMPK信号通路抑制中枢神经炎症应答

发布时间：2016-11-02 17:33

  本文关键词：“废气不废”:气体信号分子硫化氢的研究进展，由笔耕文化传播整理发布。

《苏州大学》 2014年

硫化氢通过CaMKKβ-AMPK信号通路抑制中枢神经炎症应答

周晓梅  

【摘要】：目的：硫化氢（hydrogen sulfide, H2S）是重要的内源性气体信号分子，可以抑制中枢神经炎症，但机制不明。已有研究表明H2S可能通过核因子-kappaB（NF-κB）和p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路抑制中枢神经炎症。本课题的目的在于探索H2S是否通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）信号通路促进脑内炎症细胞—小胶质细胞（microglia, MG）向M2另类活化状态转化从而发挥抑制神经炎症应答的作用。 方法：利用BV-2小胶质细胞系及小鼠原代小胶质细胞，通过脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激建立体外小胶质细胞神经炎症模型。利用三种结构不同的H2S供体（NaSH/GYY4137/ADT-OH）以及过表达内源性H2S合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase, CBS）的策略研究H2S抑制中枢神经炎症的机制。应用Griess试剂法通过检测炎症介质NO的生成探索H2S供体抑制小胶质细胞炎症应答的有效药物浓度范围及最佳效应浓度；应用Western Blot法检测AMPK活化（磷酸化）、CBS表达及AMPK的上游激酶—Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶激酶β（Ca2+/calmodulin dependent protein kinase kinase beta, CaMKKβ）表达水平的变化；应用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR）和酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）技术测定表征M1（促炎状态）/M2（另类活化状态）细胞因子表达水平的变化；同时应用AMPK和CaMKKβ抑制剂或siRNA干扰技术探索H2S抑制中枢神经炎症的作用是否依赖于AMPK/CaMKKβ。最后，通过侧脑室注射LPS建立小鼠中枢神经炎症模型，在动物水平验证H2S供体对LPS刺激导致的AMPK磷酸化及M1/M2细胞因子表达水平的影响；并应用免疫组织化学法观察磷酸化AMPK（p-AMPK）与小胶质细胞标记物Ibal的共定位情况，以明确H2S供体在动物水平对小胶质细胞活化状态及AMPK激活的作用。 结果：与溶剂对照组相比较，无论BV-2细胞有无LPS诱导活化，H2S供体（NaSH/GYY4137/ADT-OH）和CBS过表达均增加其AMPK活化水平；同时，ADT-OH和CBS过表达均促进LPS活化的BV-2细胞向M2另类活化状态转化；AMPK抑制剂和siRNA均抑制ADT-OH促进活化BV-2细胞向M2另类活化状态转化。以上实验结果说明H2S通过促进AMPK活化抑制中枢神经炎症应答。 肝激酶B1(1iver-kinase B1, LKB1)是激活AMPK的上游激酶，但ADT-OH在不表达LKB1的HeLa细胞中也能促进AMPK活化；而CaMKKβ抑制剂和siRNA均抑制ADT-OH促进BV-2细胞AMPK活化及其向M2另类活化状态转化。这些结果表明，H2S通过CaMKKβ而不是LKB1激活AMPK信号通路发挥抑制神经炎症应答的作用。 在LPS刺激小鼠原代小胶质细胞的模型上，ADT-OH也促进原代小胶质细胞AMPK活化及其向M2另类活化状态转化；AMPK和CaMKKβ抑制剂均抑制ADT-OH促进小胶质细胞AMPK活化及其向M2另类活化状态转化。 在侧脑室注射LPS建立的小鼠中枢神经炎症模型中，ADT-OH和NaSH均促进小鼠小胶质细胞活化密集区域—脑外侧隔区复合体AMPK活化，并且ADT-OH抑制该区域脑组织M1细胞因子的表达而上调M2细胞因子的表达水平；荧光免疫组化结果显示在同时注射LPS和ADT-OH的小鼠脑外侧隔区复合体可见Ibal+细胞与p-AMPK共染。这部分结果从动物水平上证实H2S通过激活小胶质细胞AMPK抑制中枢神经炎症应答。 结论与创新：H2S通过CaMKKβ-AMPK信号通路抑制中枢神经炎症应答。

【关键词】：
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741
【目录】：

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