阿霉素—血小板载药体系的构建及其抗淋巴瘤效应的研究

发布时间：2017-04-04 11:16

  本文关键词：阿霉素—血小板载药体系的构建及其抗淋巴瘤效应的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的以血小板为载体制备阿霉素-血小板载药体系,研究其基本特性。观察载药后血小板形态、部分膜蛋白的表达及聚集功能的改变。观察阿霉素搭乘血小板后对Raji细胞及Burkitt淋巴瘤裸鼠模型的作用,通过作用于新生裸鼠原代心肌细胞及Burkitt淋巴瘤裸鼠模型,考察心肌毒性。方法(1)将全血离心、洗涤得到洗涤血小板(platelet),与不同浓度的DOX充分混合反应,通过2B分离柱分离后得到包载阿霉素的血小板(DOX-platelet); (2)高效液相色谱仪、电子秤计算载药率(drug loading, DL)和包封率(encapsulation efficiency, EE),荧光显微镜考察DOX是否被血小板包载,扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察DOX包载于血小板后对血小板的形态有无影响,蛋白印迹(western blotting)法检测血小板膜蛋白CD41、CD61及CD47的表达,血小板聚集仪检测血小板及包载阿霉素后血小板的聚集功能,体外透析实验检测DOX-platelet中DOX的释放性能；(3)Cell counting kit-8试剂盒检测不同浓度DOX对Raji细胞增殖抑制作用,计算IC50值作为实验浓度,DOX-platelet组则根据载药量计算,给予相当于含等量DOX的DOX-platelet。将Platelet、DOX及DOX-platelet与Raji细胞株及新生裸鼠原代心肌细胞共培养24h、48h、72h后计算细胞增殖抑制率；(4)流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测各实验组细胞的凋亡率；(5)共聚焦显微镜观察各实验组经DAPI染色后细胞凋亡的形态学改变；(6)FCM检测细胞内DOX的药物浓度。(7)逆转录-聚合酶连反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)法和、vestern法分别检测各实验组Bad、Bcl-xl、Caspase9、P53的基因和蛋白表达水平；(8)建立Burkitt淋巴瘤小鼠模型成功后将其分成Control、Platelet、DOX、DOX-platelet四个处理组,监测各组裸鼠体重及瘤块体积改变；(9)HE染色观察各处理组裸鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肿瘤的组织病理学改变；(10)RT-PCR法和western法分别检测各实验组裸鼠瘤体Bad、Bcl-xl、Caspase9、P53的基因和蛋白表达水平。结果(1)DOX-platelet的表征Ⅰ.DOX可以被包载于血小板内,且计算得DOX-platelet的载药率为46.3%,包封率为86.6%；Ⅱ. DOX搭乘血小板后对血小板的形态无明显影响,血小板和包载阿霉素后血小板的聚集功能及血小板膜蛋白CD41、CD47、D61表达量均无明显改变(P0.05)；Ⅲ.在pH为5.5的环境中,36h内DOX-platelet中DOX累积释放率达到84.4%,而在pH=7.4及pH=8.4的环境中累积释放率均小于40%。(2) Raji细胞及新生裸鼠原代心肌细胞增殖抑制率：Ⅰ. DOX对Raji细胞增殖的抑制作用呈明显的时间和浓度依赖性,且计算得24h的IC50为0.243ug/ml;Ⅱ. Platelet组与Control组比较,对Raji细胞及原代心肌细胞增殖抑制率的差异均无统计学意义；Ⅲ.作用Raji细胞24h、48h及72h后,DOX组对细胞增殖抑制率分别为(52.06±3.5)%、(61.90±4.0)%、(72.30±4.1)%,DOX-platelet组对细胞增殖抑制率为(65.80±3.0)%、(85.23±3.7)%、(90.60±3.4)%,两组与空白对照组相比差异均具有统计学意义,且DOX-platelet组的作用更为显著,与DOX组比较差异具有统计学意义(作用24h及48h的P0.05,作用72h的P0.01)；Ⅳ. DOX与DOX-platelet作用于原代心肌细胞24h、48h、72h,比较两组对细胞增殖的抑制率后发现,DOX-platelet组可明显减轻对细胞的增殖抑制作用(P0.01)。(3)FCM检测Raji细胞凋亡率及DAPI观察Raji细胞凋亡形态学改变：Ⅰ.作用Raji细胞24h后,Control、Platelet、DOX、DOX-platelet四组总凋亡率分别为(5.9±0.52)%,(14.6±1.21)%,(50.5±5.01)%和(73.1±8.37)%,DOX及DOX-platelet组细胞凋亡较Control组均明显增加(P0.01),且DOX-platelet较DOX组增加更为明显(P0.01)；Ⅱ. DOX及DOX-platelet两组均可见到细胞凋亡的特征性改变,且在DOX-platelet组中可见到更多的凋亡小体及细胞碎片。(4)FCM检测Raji细胞内DOX浓度：DOX及DOX-platelet组细胞内DOX浓度较Control组均增加(P0.01),且DOX-platelet与DOX比较增加更为显著(P0.05)。(5) RT-PCR及western Blot法分别检测Bad、Bcl-xl、Caspase9和P53基因和蛋白表达水平：DOX及DOX-platelet两组与Control组比较,Bad、Caspase9和P53基因和蛋白表达水平均明显上调(P0.05), Bcl-xl基因和蛋白表达水平明显下调(P0.05),且DOX-platelet组的作用强于DOX组。(6)各治疗组裸鼠体重及肿瘤体积变化Ⅰ.DOX及DOX-platelet两组裸鼠肿瘤体积较Control组明显下降(P0.01),且DOX-platelet组较DOX组更为显著(P0.01)。Ⅱ.只有DOX组裸鼠体重较Control组显著下降(P0.01),Platelet组及DOX-platelet组与Control组相比无明显差异(P0.05)；(7)HE染色观察各处理组裸鼠组织病理学改变除DOX组的心肌细胞可见不同程度的坏死变性及炎症细胞浸润等,其余各组各组织均未见到明显改变。(8) RT-PCR法和western法检测裸鼠肿瘤组织Bad、Bcl-xl、Caspase9和P53基因及蛋白表达水平DOX及DOX-platelet两组与Control组比较,Bad、Caspase9和P53基因及蛋白表达水平均明显上调,Bcl-xl基因表达水平明显下调,且DOX-platelet组的作用强于DOX组,差异具有统计学意义。结论(1)血小板包载阿霉素后其形态、部分膜蛋白表达及聚集功能均无明显改变；(2)DOX-platelet可有效促进DOX对Raji细胞增殖的抑制作用、减轻DOX对新生裸鼠原代心肌细胞的抑制作用,可促进细胞凋亡,增加细胞内DOX药物浓度,上调Raji细胞Bad、Caspase9和P53基因和蛋白的表达水平,下调Bcl-xl的表达水平；(3)DOX-platelet可有效促进DOX抑制Burkitt淋巴瘤裸鼠肿瘤的生长,减轻对裸鼠心肌的损害,上调荷瘤裸鼠肿瘤组织Bad、Caspase9和P53基因和蛋白的表达水平,下调Bcl-xl的表达水平。
【关键词】：载药体系 血小板 阿霉素 淋巴瘤
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-15
• 第一部分 新型阿霉素-血小板载药体系的构建15-22
• 1 材料与方法15-16
• 2 实验方法16-19
• 3.实验结果19-22
• 第二部分 新型阿霉素-血小板载药体系体外抗人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞的作用22-32
• 1 材料和仪器22-23
• 2 实验方法23-27
• 3 实验结果27-32
• 第三部分 新型阿霉素-血小板载药体系体内作用于淋巴瘤荷瘤裸鼠的作用32-37
• 1 材料与仪器32
• 2 实验方法32-33
• 3 实验结果33-37
• 讨论37-42
• 结论42-43
• 参考文献43-47
• 文献综述 生物药物载体在肿瘤治疗中的研究进展47-61
• 参考文献54-61
• 个人简介61-62
• 致谢62

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本文编号：285454