蛇毒抗补体蛋白CVF的试剂化制备工艺、质量标准及应用研究

发布时间：2017-04-05 10:02

  本文关键词：蛇毒抗补体蛋白CVF的试剂化制备工艺、质量标准及应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究蛇毒抗补体蛋白CVF试剂化冷冻干燥的工艺,冻干制品的质量标准以及将其用于制备内皮细胞炎症反应-相关纤溶凝血分子变化模型的研究。方法:将眼镜蛇毒粗毒通过阳离子交换层析、分子筛、阴离子交换层析分离纯化,获得CVF;通过碱性电泳及等电聚胶、高效液相色谱、飞行质谱进行纯度、分子量的鉴定;将纯化的CVF进行冷冻干燥的制剂研究,研究不同蛋白浓度(0.200、0.500、1.000mg/m L)、不同保护剂(单一保护剂:蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、BSA;复合保护剂:甘露醇分别与蔗糖、乳糖、海藻糖复配)、不同p H值(6.0、6.8、7.4)对CVF冷冻干燥的影响。在上述研究的基础上,初步确定合适的配方,进行稳定性试验:将CVF冻干样品在不同温度(6、25、37°C)下分别放置1、2、3Month后对纯度、蛋白回收率及活性进行检测;通过上述研究拟订出CVF冷冻干燥的制备工艺及相应的质量标准。然后采用CVF特异激活血清补体旁路途径,刺激人微血管内皮细胞产生炎症反应,通过ELISA检测多个时间点细胞培养上清中P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM及NO指标水平的变化,并进一步研究吡咯烷二硫氨基甲酸、白藜芦醇对以上指标变化的干预作用。结果:眼镜蛇毒粗毒通过阳离子交换层析、分子筛、阴离子交换层析分离制备的CVF在碱性电泳及等电聚胶下均为一条带,飞行质谱分析得到其分子量为144.7KD;CVF的冷冻干燥研究表明,冻干过程中CVF的蛋白回收率和活性的保留量与CVF的浓度呈正相关;使用单一保护剂的结果表明,蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇对三种浓度CVF冷冻干燥中的蛋白量回收率及活性保留量均有保护作用,且甘露醇对活性保护的效果略优于其他三个配方;三个浓度下;BSA对中低浓度的CVF的活性具有保护作用,且与正常组相比,差异具有统计学意义(P0.05或P0.01);甘露醇分别与海藻糖、蔗糖、乳糖复配对冷冻干燥中CVF的蛋白回收率及活性保留量均有保护作用,在高浓度时,三个组别的蛋白量与正常组相比,具有统计学意义(P0.05),三者间无显著差异;p H值为7.4时,三个浓度下CVF的蛋白回收率及活性保留量均高于p H值为6.0、6.8时CVF的蛋白量及活性;稳定性实验结果显示,CVF于6、25、37°C条件下放置1、2、3Mon时,甘露醇与海藻糖复合配方组对CVF有较好的保护作用。其中,不同条件下CVF的蛋白回收率无明显变化;6°C条件下放置1-3 Mon时甘露醇与蔗糖配方的CVF活性几乎无损失;25°C条件下,随着放置时间增加其活性略有降低;37°C条件下放置时,其活性降低,在3 Mon时尤为明显。根据上述CVF的分离纯化、冷冻干燥、纯度检测、蛋白回收率测定、活性测定的研究,初步确定了CVF试剂化制备工艺的小试条件及相应的质量标准;在CVF特异激活微血管内皮细胞致炎症反应的模型中,P-selectin、VWF的表达快速上调,其高峰时间为15min,而纤溶功能分子t-PA、PAI-1也随后出现持续上调表达,与凝血功能相关的组织因子TF表达水平持续上调,而血栓蛋白TM及NO的表达下降;吡咯烷二硫氨基甲酸、白藜芦醇对P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF上调表达具有抑制作用,而对TM及NO表达水平的下调具有干预作用。结论:通过本研究初步建立了切实可行的CVF试剂化制备的小试工艺,稳定性好,可控制性强,并初步拟定了相应的质量标准,能为CVF的进一步应用提供了科学依据和参考。采用CVF特异激活补体旁路刺激人微血管内皮细胞,会导致内皮细胞中纤溶凝血相关分子表达的变化,白藜芦醇对此变化具有干预作用。以上研究,这能为新药的筛选和研发提供合适的细胞模型和参考依据。
【关键词】：补体 CVF 补体旁路活化 冷冻干燥 内皮细胞 纤溶 凝血
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 第一章 蛋白质冷冻干燥的研究进展8-15
• 1 冷冻干燥概述8
• 2 冷冻干燥的应用8-9
• 2.1 食品工业8
• 2.2 医疗工业8-9
• 2.3 菌种保藏9
• 2.4 其他9
• 3 蛋白质冷冻干燥的损伤机理9-10
• 4 蛋白质冷冻干燥中的影响因素10-11
• 4.1 温度10
• 4.2 浓度效应10-11
• 4.3 p H值11
• 4.4 相分离11
• 5 蛋白冷冻干燥中的保护机理及保护剂11-13
• 5.1 保护机理11-12
• 5.2 蛋白质冷冻干燥中的保护剂12-13
• 5.2.1 糖和多羟基类12-13
• 5.2.2 氨基酸13
• 5.2.3 聚合物13
• 6 结语与展望13-15
• 第二章 蛇毒抗补体蛋白CVF的冷冻干燥工艺及质量标准的研究15-47
• 1 实验材料17-18
• 1.1 试剂和材料17
• 1.2 实验动物17
• 1.3 主要仪器17-18
• 1.4 主要溶液的配制18
• 2 实验方法18-23
• 2.1 CVF的分离纯化18-19
• 2.2 纯度及分子量鉴定19-20
• 2.3 CVF的冷冻干燥20-23
• 2.4 蛋白定量23
• 2.5 CVF的活性测定23
• 2.6 相对抗补体活力的计算23
• 2.7 统计学分析23
• 3 实验结果23-44
• 3.1 CVF的分离纯化24-26
• 3.2 纯度鉴定26-28
• 3.3 CVF的冷冻干燥28-44
• 4、讨论44-47
• CVF试剂化制备的实验室小试工艺（草案）47-49
• CVF冻干制剂的质量标准（草案）49-52
• 第三章 CVF激活补体旁路致内皮细胞纤溶凝血相关分子表达变化及干预研究52-67
• 1. 实验材料53-56
• 1.1 主要试剂53
• 1.2 主要仪器53-54
• 1.3 细胞株54
• 1.4 眼镜蛇毒因子54
• 1.5 主要溶液的配制54-55
• 1.6 人血清制备55
• 1.7 人血清补体活性检测55-56
• 2、实验方法56-58
• 2.1 CAC对HMEC凝血纤溶相关蛋白分子表达的影响56-57
• 2.2 PDTC、Res对CAC刺激HMEC表达纤溶凝血相关分子表达变化的影响57-58
• 2.3 统计学分析58
• 3、实验结果58-65
• 3.1 CAC对HMEC纤溶凝血相关分子表达的影响58-61
• 3.2 PDTC和Res对HMEC凝血纤溶相关分子表达变化的干预作用61-65
• 4 讨论65-67
• 第四章 结论67-68
• 致谢168-69
• 致谢269-70
• 参考文献70-79
• 附录一79-80
• 附录二80-82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘占杰,华泽钊;蛋白质药品冷冻干燥过程中变性机理的研究进展[J];中国生化药物杂志;2000年05期

  本文关键词：蛇毒抗补体蛋白CVF的试剂化制备工艺、质量标准及应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：286879