一类新药HZZ112的代谢、酶诱导抑制和蛋白结合研究

发布时间：2017-04-14 01:10

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【摘要】：HZZ112是治疗肺癌的化药1.1类候选新药,其一级活性代谢物HZZ1018能够抑制角质细胞增生,并能进一步代谢生成二级代谢产物HZZ1005。本文对其临床前药物代谢动力学进行研究,主要考察了其生物转化和血浆蛋白结合情况,比较了不同物种间代谢动力学行为,探究了HZZ112及其活性代谢物HZZ1018和HZZ1005对主要的CYPs的抑制和诱导作用,并对介导HZZ112和HZZ1018代谢的酶系做了初步验证,为HZZ112进一步开展临床前药物代谢动力学研究,药效学和毒理学研究动物模型的选取等提供参考信息。1 HZZ112活性代谢物分析目的 考察HZZ112在大鼠体内是否产生活性代谢物HZZ1018和HZZ1005,以及通过体外实验分析其化学结构。方法收集大鼠灌胃给予HZZ112后的血浆和尿液,采用HPLC-Q-TOF/MS方法获得HZZ112在大鼠血浆和尿液中的代谢物的一级和二级质谱图；通过体外比格犬血细胞孵育HZZ112和人肝微粒孵育HZZ1018等试验,进行代谢物分析。结果 给药后,大鼠血浆和尿液中均能检测到HZZ1018和HZZ1005分子离子峰,并且其质谱二级碎裂图符合两种化合物的碎裂规律。在体外实验中,HZZ112在比格犬血细胞中生成活性代谢物HZZ1018,而HZZ1018在人肝微粒体中经羰基还原生成HZZ1005,未发现α,β-不饱和醛酮C=C双键还原产物。结论 通过体内和体外实验证明,HZZ112的活性代谢物主要为HZZ1018和HZZ1005。HZZ1018在人肝微粒体中主要发生羰基还原生成HZZ1005,没有检测到C=C双键还原产物HZZ1018*(HZZ1018的二氢呋喃态)。2 HZZ1018在不同物种肝微粒体及肝胞浆中的代谢动力学目的 比较HZZ1018在小鼠、大鼠、犬、猪和人不同物种肝微粒体及肝胞浆中代谢生成HZZ1005的代谢动力学行为的差异。方法 建立灵敏、简便的肝微粒体中测定HZZ1005的HPLC方法；对HZZ1018体外孵育实验的酶浓度和孵育时间进行优化；以不同底物浓度下产物生成速率绘制酶动力学曲线,采用米氏方程拟合酶动力学参数。结果 建立了HPLC方法用于测定孵育体系中的还原产物HZZ1005,并且优化了HZZ1018的体外孵育时间和酶浓度。为了保证底物HZZ1018的消耗量不大于20%,并避免蛋白质的非特异性吸附,同时满足HPLC检测的灵敏度,最终确定HZZ1018在体外孵育系统中的条件：蛋白浓度为0.4 mg/mL,孵育时间为40 min。HZZ1018转化为HZZ1005的代谢动力学均符合经典米氏方程。通过比较包括Km,Vmax和Clint在内的动力学参数,小型猪肝微粒体中的代谢与人肝微粒体中的代谢最为相似,其他物种均有很大不同；而在胞浆中的代谢,不同物种间差异很小。另外,值得注意的是,胞浆中代谢的清除率数值是肝微粒体中的一百多倍,这提示我们HZZ1018的代谢的主要发生在胞浆中。结论小型猪肝微粒体的代谢与人较为相似,不同物种间的胞浆代谢差异很小。HZZ1018在胞浆中的清除率要远远高于在微粒体中的清除率。3 参与HZZ112和HZZ1018代谢的酶研究目的 筛查介导HZZ112酯链断裂和HZZ1018羰基还原的酶系。方法 1)通过加入CYPs的特异性抑制剂和利用FMOs的高温失活的特性,考察HZZ112和HZZ1018是否由CYPs和FMOs代谢,并确定是否依赖于NADP-NADPHo 2)用相关性分析实验考察HZZ1018的代谢与主要的CYPs亚族是否有关。3)采用双香豆素、华法林与HZZ1018在胞浆中共孵育方法,观察HZZ1018的双键是否能被还原。4)通过一系列体外孵育实验和重组酶实验,考察HZZ112的代谢与乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、对氧磷酶的关系。结果1)HZZ1018的代谢与FMOs无关,与CYPs有关,但CYPs不是主要的代谢酶,并且HZZ1018的代谢依赖于NADP-NADPH(辅酶)的参与;HZZ112在肝微粒体和肝胞浆中均无代谢。2)相关性分析实验结果显示,HZZ1018的代谢与几种CYP亚型探针底物代谢活性的相关性较差,提示它们都不是HZZ1018代谢为HZZ1005的主要代谢酶。3)香豆素类药物对HZZ1018的代谢没有显著性抑制作用。4)HZZ112在比格犬血浆中(高表达乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶和对氧磷酶)和大鼠肝微粒体(高表达羧酸酯酶)中末发生明显代谢。5)重组酯酶rhCE1、 hCE2、rhPON1和BChE对HZZ112无代谢。6)HZZ112在血浆中无代谢,在血细胞中有代谢。结论1)HZZ112在各不同物种的肝微粒体及肝胞浆中均无代谢,但其在全血中有代谢,代谢物HZZ1018主要在血细胞中生成。HZZ1018在胞浆中的代谢速率要远大于其在微粒体中的代谢,其代谢与CYPs有关,但CYPs并不是其最主要的代谢酶。2)HZZ112的代谢很可能与血细胞中的特异性酯酶有关,而HZZ1018的代谢则可能与胞浆中AKR1C家族有关。4 HZZ112及其代谢物对主要CYPs的抑制作用目的 通过检测HZZ112及其代谢物对主要CYPs的抑制作用,考察HZZ112潜在的药物-药物相互作用。方法 采用鸡尾酒法,在人肝微粒体孵育体系中,将HZZ112或其代谢物与多种CYP酶探针底物共孵育,通过探针底物的代谢速率变化评价待测物对主要药物代谢酶活性的影响。研究了HZZ112及其代谢物对细胞色素P450同工酶CYP1A2、 2B6、2C8、2C9、2C19、2D6和3A4/5的抑制作用。结果本实验建立了快速灵敏的HPLC-MS/MS方法同时检测微粒体孵育液中CYP酶探针底物的代谢物。实验结果发现,HZZ112对CYP1A2,2B6,2C8,2C9,2C19,2D6和3A4/5都没有明显的抑制作用,IC50100μmol/L(50 μg/mL);而HZZ1018和HZZ1005对CYP1A2,2B6,2C8,2C9,2C19,2D6和3A4/5都表现出很强的抑制作用。结论HZZ112对CYP1A2,2B6,2C8,2C9,2C19,2D6和3A4/5无明显抑制作用,而其代谢物HZZ1018和HZZ1005对它们都表现出很强的抑制作用。5 HZZ112及其代谢物对CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6的诱导作用目的考察HZZ112及其代谢物对CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6有无诱导作用。方法 本文首先通过双荧光素酶报告基因法研究HZZ112、HZZ1018和HZZ1005对CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6的可能诱导作用,然后采用real-time PCR法考察它们对人肝癌细胞HepG2中CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6mRNA表达的影响以及小鼠经多次给药后肝组织中三种酶同工酶mRNA表达量的变化。结果 双荧光素酶报告基因测定结果显示,除了HZZ112高剂量组有弱的通过激活人芳烃受体(hAhR)诱导CYP1A2的作用外,其他药物均不表现出诱导作用。real-time PCR实验结果显示,在HepG2细胞中,高剂量的HZZ112会诱导CYP1A2 mRNA表达水平增加,高剂量的HZZ1018弱诱导CYP2B6,高剂量的HZZ1005弱诱导CYP3A4;给药HZZ112的小鼠肝组织中的CYP1A2 mRNA水平也有增高,CYP3A11和CYP2B10基因的mRNA表达水平没有改变。结论HZZ1018和HZZ1005对CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6没有诱导作用。高剂量的HZZ112对CYP1A2的mRNA表达有较弱的诱导作用,对CYP3A4和CYP2B6没有诱导作用。6 HZZ112和HZZ1018的血浆蛋白结合目的考察HZZ112和HZZ1018与人、犬、大鼠血浆的蛋白结合情况。方法 采用超速离心法考察三种药物的蛋白结合率。人、大鼠和犬血浆中HZZ112或HZZ1018的浓度分别为2,20和200μmol/L,在4℃下,以500,000 g离心17h,拨开上层脂蛋白取中层澄清液体,处理后检测即得游离药物浓度,进而计算得出HZZ112和HZZ1018的血浆蛋白结合率。结论HZZ112和HZZ1018在人、犬、大鼠血浆中均有很高的蛋白结合率(大于95%)。
【关键词】：药物代谢 诱导 抑制 药物相互作用 血浆蛋白结合
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-10
• Abstract10-15
• 缩略词15-20
• 1 前言20-24
• 1.1 临床前药物代谢动力学20
• 1.2 药物的生物转化20-21
• 1.3 药物相互作用21-22
• 1.4 药物的血浆蛋白结合22
• 1.5 研究内容和实验方案22-24
• 2 HZZ112活性代谢产物鉴定24-37
• 2.1 引言24
• 2.2 实验仪器与材料24-25
• 2.3 实验方法25-28
• 2.4 实验结果28-36
• 2.5 小结与讨论36
• 2.6 结论36-37
• 3 HZZ112和HZZ1018不同物种的代谢轮廓比较37-49
• 3.1 引言37
• 3.2 实验仪器与材料37-40
• 3.3 实验方法40-43
• 3.4 实验结果43-48
• 3.5 小结与讨论48
• 3.6 结论48-49
• 4 介导HZZ112和HZZ1018生物转化的酶系研究49-62
• 4.1 引言49
• 4.2 实验仪器与材料49-50
• 4.3 实验方法50-55
• 4.4 实验结果55-60
• 4.5 小结与讨论60-61
• 4.6 结论61-62
• 5 HZZ112及其活性代谢物对CYPs的抑制作用62-71
• 5.1 引言62
• 5.2 实验仪器与材料62-63
• 5.3 实验方法63-65
• 5.4 实验结果65-70
• 5.5 讨论70
• 5.6 结论70-71
• 6 HZZ112及其活性代谢物对CYPs的诱导作用71-87
• 6.1 引言71
• 6.2 实验仪器与材料71-73
• 6.3 实验方法73-78
• 6.4 实验结果78-85
• 6.5 小结与讨论85-86
• 6.6 结论86-87
• 7 HZZ112和HZZ1018在血浆中的蛋白结合情况87-95
• 7.1 引言87
• 7.2 实验仪器与材料87-88
• 7.3 实验方法88-90
• 7.4 实验结果90-94
• 7.5 小结与讨论94
• 7.6 结论94-95
• 本研究的总结95-96
• 本研究的创新点96-97
• 参考文献97-100
• 综述100-113
• 参考文献110-113
• 作者简历113

【参考文献】

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1 张景园,施善平;乙酰胆碱酯酶的别构作用——某些胆碱能效应剂与钙离子激活作用的关系[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1982年05期

  本文关键词：一类新药HZZ112的代谢、酶诱导抑制和蛋白结合研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：304874