NGR肽和CPPs肽协同介导的超声脂质微泡肿瘤靶向递送siRNA的研究

发布时间：2017-04-19 08:45

  本文关键词：NGR肽和CPPs肽协同介导的超声脂质微泡肿瘤靶向递送siRNA的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞穿透肽(Cell penetrating peptides,CPPs)具有良好的细胞膜穿透功能,但同时又有明显的缺点,使其在体内的应用效果不是很理想。缺点主要有以下两点:(1)CPPs缺乏组织特异性,可以穿透它所遇到的每个细胞的细胞膜;(2)其在血液循环时易被血液中的酶降解。CPPs的这些缺点使得它在到达靶细胞之前必须进行功能掩蔽,到达靶细胞之后再通过内部或外部刺激的方式对其进行激活。超声脂质微泡(Ultrasonic Lipid microbubble,ULM)作为一种新型的药物载体,不仅可以增强超声显像效果,还具有靶向治疗作用。它作为载体时的主要优点有:(1)具有物理化学靶向性,利用一定强度的超声在肿瘤靶区的体表定位辐照,超声介导微泡的空化效应可导致微泡在肿瘤靶组织内破裂,微泡所携带的药物会迅速释放到肿瘤靶区,实现靶向释药的目的;(2)提高转染效率,微泡内气体破裂瞬间,会在局部产生很高的能量冲击,导致靶细胞膜轻度可逆损害,膜通透性增高,从而对基因药物摄入增强。因此,我们可以集成超声脂质微泡和CPPs的优势功能,互补互利,保证基因药物在体内获得高转染效率。本研究的主要内容就是构建一种全新的多功能集成的基因载体。与现有文献报道的基因载体不同,本研究采用把CPPs与小干扰RNA(small-interfering RNA,siRNA)以共价物形式包入超声脂质微泡内实现对CPPs到达靶细胞之前的功能掩蔽,在靶部位给予一定功率的超声辐照,使微泡内气体振荡、扩大至爆破,一方面可以增高靶细胞膜的通透性,从而增强靶细胞对基因药物的摄入,另一方面可以将超声脂质微泡包载的CPPs暴露出来,实现CPPs的功能激活。本研究工作主要包括以下三部分:(1)功能材料NGR-PEG2000-DSPE和CPPs-siRNA共价物的合成和表征;(2)CPPs-siRNA/NGR-ULM的制备和理化性质表征;(3)对所制备的CPPs-siRNA/NGR-ULM进行体外细胞评价,主要考察CPPs-siRNA/NGR-ULM被HT-1080细胞的摄取情况、细胞内的分布以及细胞凋亡状况。在肿瘤细胞模型水平对载体的肿瘤靶向和转染效率进行评价。首先,利用siRNA的正义链的5’末端巯基和CPPs末端巯基之间的氧化反应合成了二硫键连接的CPPs-siRNA,采用MALDI-TOF质谱确认了产物的成功合成。然后采用迈克尔加成反应制备了功能材料NGR-PEG2000-DSPE,同样采用MALDI-TOF质谱对合成产物进行了确认。再采用薄膜分散/超声法,通过反复冻融以及超声加气的方法制备了CPPs-siRNA/ULM和CPPs-siRNA/NGR-ULM,并对其理化性质进行了表征。结果显示,所制备样品为不规则多边形粒子,粒径约为150 nm,包封率约为85%,24 h内稳定性良好,且在机械指数(mechanical index,MI)为0.6的条件下超声辐照5 min,CPPs-siRNA的释放度可达80%以上。以人纤维肉瘤细胞(HT-1080 cells)为模型细胞,对所制备的CPPs-siRNA/ULM和CPPs-siRNA/NGR-ULM进行了体外细胞水平的评价。结果显示,NGR肽的修饰可以显著增加CPPs-siRNA/NGR-ULM对CD13高表达的HT-1080细胞的结合力。激光共聚焦显微镜观察发现,超声激活后的CPPs-siRNA/NGR-ULM进入胞内后能够有效逃逸晚期内涵体/溶酶体。且引入的靶向修饰基团和超声激活处理能够显著增强CPPs-siRNA/NGR-ULM的基因沉默效应,实现了最显著的肿瘤细胞凋亡(约54%)。NGR肽、超声脂质微泡以及超声激活的CPPs的协同作用,显著提高了CPPs-siRNA/NGR-ULM超声激活组被HT-1080细胞的摄取率及对HT-1080细胞的增殖抑制效果。基于上述结果,NGR肽和可超声激活CPPs协同作用的超声脂质微泡作为一种新型多功能集成载体,显示了较理想的细胞抗肿瘤效果,为恶性肿瘤靶向治疗研究领域开辟了新途径。
【关键词】：超声脂质微泡 NGR靶头 细胞穿透肽 小干扰RNA c-myc基因
【学位授予单位】：湖北科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 缩略词表4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-12
• 第一部分 功能材料的合成12-16
• 1 仪器和材料12-13
• 2 实验方法13
• 3 实验结果13-14
• 4 讨论14-15
• 5 小结15-16
• 第二部分CPPs-si RNA/NGR-ULM的制备和表征16-26
• 1 仪器和材料16-17
• 2 实验方法17-19
• 3 实验结果19-24
• 4 讨论24-25
• 5 小结25-26
• 第三部分CPPs-si RNA/NGR-ULM的体外细胞评价26-36
• 1 仪器和材料26-27
• 2 实验方法27-29
• 3 实验结果29-34
• 4 讨论34
• 5 小结34-36
• 参考文献36-39
• 文献综述39-53
• 参考文献48-53
• 攻读学位期间取得的学术成果53-54
• 致谢54

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本文编号：315835