Mcl-1在3-溴丙酮酸诱导乳腺癌细胞凋亡敏感性中的作用

发布时间：2017-05-11 12:07

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【摘要】：目的:1.探究3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate,3-Br PA)对人乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响。2.研究3-Br PA诱导乳腺癌细胞凋亡对Caspase的依赖性。3.探讨ROS在3-BrPA诱导乳腺癌细胞产生凋亡中的作用。4.探讨PI3K/Akt通路在3-Br PA诱导乳腺癌细胞凋亡过程中的作用。5.探讨Mcl-1在乳腺癌细胞对3-Br PA诱导凋亡敏感性中的作用。方法:1.MTT法检测3-Br PA处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435后对细胞存活率的影响。2.溴化丙啶(propidium iodide,PI)单染法及Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测药物处理乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435 24 h后对细胞存活率的影响。3.DHE检测试剂盒检测3-Br PA(160?mol·L-1)处理人乳腺癌细胞MDA-MB-2311 h、3 h及6 h后细胞内超氧阴离子水平。4.ATP检测试剂盒检测不同浓度3-Br PA(40,80,160?mol·L-1)处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435 6 h后细胞内ATP水平。5.Western blot法检测3-Br PA处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231对凋亡相关蛋白Mcl-1表达及PI3K/Akt信号通路的影响。6.利用si RNA技术下调Mcl-1观察MDA-MB-435细胞对3-Br PA诱导其凋亡敏感性的变化。7.利用过表达技术上调Mcl-1观察MDA-MB-231细胞对3-Br PA诱导其凋亡敏感性的变化。结果:1.不同浓度3-Br PA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435增殖及凋亡的影响1.1使用不同浓度3-Br PA(10,20,40,80,160?mol·L-1)分别处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435 24 h,48 h及72 h,MTT法检测细胞存活率,实验结果显示,3-Br PA对乳腺癌细胞MDA-MB-231有增殖抑制作用,且随着浓度的增加和作用时间的延长,3-Br PA对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用也不断增强,而MDA-MB-435细胞在此浓度范围未发现增殖抑制现象。1.2 3-Br PA(40,80,160?mol·L-1)分别处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435 24 h,PI单染法检测结果显示:随着3-Br PA浓度的增加,MDA-MB-231细胞的凋亡率逐渐增多,而MDA-MB-435细胞的凋亡率无明显变化。Annexin V-FITC/PI双染法进一步验证MDA-MB-231凋亡情况,结果与单染法所得结果一致。2.3-Br PA诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231发生凋亡是非caspase依赖的2.1使用160??mol·L-1 3-Br PA分别处理MDA-MB-231细胞6 h,16 h及24 h,Western blot结果显示:与对照组相比,16 h组和24 h组有一定的Caspase-8和Caspase-3的激活。2.2使用160??mol·L-1 3-Br PA分别处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231 1 h,3 h及6 h,DHE检测结果显示:随着时间的延长,MDA-MB-231细胞内活性氧逐渐增多。2.3 ATP实验结果显示,3-BrPA(40,80,160??mol·L-1)对两株乳腺癌细胞内的ATP生成均起到抑制作用,且呈浓度依赖性。2.4为了进一步确认3-Br PA诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡是否为caspase依赖,我们使用160?mol·L-1 3-Br PA和Caspase抑制剂z-VAD-fmk(20?mol·L-1)联合处理MDA-MB-231细胞,结果显示,z-VAD-fmk对发生凋亡的MDA-MB-231细胞不具有保护作用。3.3-Br PA通过PI3K/Akt信号通路调节Mcl-1的表达3.1使用160?mol·L-1 3-Br PA分别处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-435 6 h,16 h及24 h,Western blot结果显示:在MDA-MB-231细胞中,24 h组Mcl-1及p-Akt的表达量较对照组,16 h组及6 h组明显降低;而在MDA-MB-435细胞中,6 h组、16 h组级24 h组较对照组有所上升。3.2使用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002(10?mol·L-1)分别处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231 6 h、16 h及24 h后,Western bolt检测结果显示24 h组Mcl-1的表达量较对照组,16 h组及6 h组明显降低。实验结果显示:3-Br PA诱导MDA-MB-231细胞产生的凋亡可能是通过PI3K/Akt通路下调凋亡相关蛋白Mcl-1引起的。4.下调Mcl-1表达可增强MDA-MB-435细胞对3-Br PA诱导凋亡的敏感性4.1用Mcl-1 si RNA预处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231,24 h后,Western bolt检测Mcl-1表达量明显降低。沉默Mcl-1的表达后,用160?mol·L-1 3-Br PA处理MDA-MB-231细胞24 h,使用MTT法检测其存活率,并与对照组相比较。实验结果显示:与对照组相比,Mcl-1 si RNA预处理后,3-Br PA诱导MDA-MB-435细胞发生凋亡在一定程度被增强了。4.2 Western blot结果显示:沉默Mcl-1的表达后,使用160?mol·L-1 3-Br PA处理MDA-MB-435细胞24 h,与对照组相比,处理组有一定的Caspase-3的激活。5.上调Mcl-1表达可降低MDA-MB-231细胞对3-Br PA诱导凋亡的敏感性5.1用Mcl-1 c DNA预处理人乳腺癌细胞MDA-MB-231,24 h后,Western bolt检测Mcl-1表达量明显升高。过表达Mcl-1后,用160?mol·L-1 3-Br PA处理MDA-MB-231细胞24 h,使用MTT法检测其存活率,并与对照组相比较。实验结果显示:与对照组相比,Mcl-1 c DNA预处理后,3-Br PA诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡一定程度被抑制。5.2 Western blot结果显示:过表达Mcl-1后,使用160?mol·L-1 3-Br PA处理MDA-MB-231细胞24 h,处理组Caspase-3未发现激活,细胞受到保护。结论:1.3-Br PA可以诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡。2.3-Br PA诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的过程中伴随着活性氧的升高。3.调节Mcl-1的表达可能是3-Br PA诱导乳腺癌细胞凋亡的机制之一。
【关键词】：乳腺癌 3-溴丙酮酸 氟甲基酮 凋亡 髓细胞白血病-1 活性氧
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 材料与方法15-28
• 1.材料与仪器15-17
• 2.实验方法17-27
• 2.1 细胞培养17
• 2.2 MTT法检测细胞存活率17-18
• 2.3 DHE 荧光探针检测药物对细胞 ROS 的影响18-19
• 2.4 PI染色流式细胞术检测细胞凋亡19-20
• 2.5 Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡20-21
• 2.6 ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平变化21-22
• 2.7 免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达22-26
• 2.8 siRNA 下调乳腺癌细胞凋亡相关蛋白的表达26-27
• 2.9 cDNA 上调乳腺癌细胞凋亡相关蛋白的表达27
• 3. 统计学处理27-28
• 结果28-38
• 1. 不同浓度 3-Br PA 对乳腺癌 MDA-MB-231 和 MDA-MB-435 细胞增殖和凋亡的影响28-29
• 2. 3-BrPA诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞发生凋亡是非caspase依赖的29-32
• 3. 3-BrPA通过PI3K/AKT通路下调乳腺癌MDA-MB-231细胞Mcl-1 的表达32-34
• 4. 下调 Mcl-1 表达可增强 MDA-MB-435 细胞对 3-Br PA 诱导凋亡的敏感性34-36
• 5. 上调 Mcl-1 表达可降低 MDA-MB-231 细胞对 3-Br PA 诱导凋亡的敏感性36-38
• 讨论38-42
• 结论42-43
• 参考文献43-46
• 致谢46-47
• 附录A：英中文术语缩略词表47-49
• 附录B：常用试剂配制49-53
• 附录C：在校期间发表的文章53-54
• 附录D：综述 3-溴丙酮酸抗肿瘤机制的研究54-60
• 参考文献58-60

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本文编号：357209