基于Hsp90-Cdc37蛋白交互作用的抗胰腺癌天然产物筛选

发布时间：2017-05-11 22:07

  本文关键词：基于Hsp90-Cdc37蛋白交互作用的抗胰腺癌天然产物筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胰腺导管腺癌(胰腺癌,Pancreatic cancer)在癌症引起的死亡人数中位列第四位。胰腺癌的死亡率与其发病率相当。中老年人人群胰腺癌发病率明显高于年轻人,其中仅有20%以下的病人表现为局部的可以治愈的肿瘤,且胰腺癌五年生存率低于5%。近几十年来,关于胰腺癌的治疗方案并没有取得很大的进步,手术治疗仍然是主要的治疗手段,而由于胰腺癌的快速扩散、晚期诊断以及耐药性导致化疗和放疗的效果并不明显。只有15-20%的患者可以进行手术切除肿瘤,而剩余的80%的晚期及肿瘤转移的病人不可以进行手术切除肿瘤,即使是那些已经切除肿瘤的病人其五年生存率仍低于15%。目前,吉西他滨是胰腺癌治疗的标准化的药物,然而其仅仅是改善了疾病症状,而对生存率并没有明显的改善。最新研究发现,热休克蛋白90(Hsp90)在癌症中扮演着非常重要的角色,与正常情况相比,Hsp90在癌细胞中表达量增加2-10倍,这就提示Hsp90可能在癌细胞的增殖和存活中扮演着非常重要的角色。最近多项研究表明,雷公藤红素、萝卜硫素可以通过阻断Hsp90蛋白与细胞分裂周期蛋白Cdc37之间的相互作用起到一定的抗胰腺癌作用,且抑制Hsp90与Cde37之间的相互作用能增强抗胰腺癌专一性并能减弱其副作用。纵观过去半个世纪的药物研发的历史,天然产物来源的药物与合成的化药相比占了很大的比重。据世界卫生组织统计,中草药中有超过21000种植物物种被全世界范围内广泛应用于疾病预防与治疗,因此,传统中药在全世界人民健康领域占有重要的地位,并且为药物研发过程中寻找新的先导化合物提供了的巨大宝库。越来越多的研究发现,许多中草药中的天然产物具有很好的抗癌活性,例如生物碱类、萜类、及黄酮类等都具有很强的抗癌活性。因此从天然产物中筛选能够阻断Hsp90与Cdc37之间相互作用并起到抗胰腺癌作用的药物及先导化合物是抗胰腺癌药物发现的一大途径。传统的抗癌药物筛选方法耗时费力且靶向性差,因此有必要建立一种体外模拟体内的快速、高效、靶向性强的抗癌药物筛选方法,从而对众多的活性天然产物进行快速的筛选。第一部分查阅文献,查找了具有抗癌作用的植物,及从抗癌植物当中分离出的天然产物,收集了天然产物600个,建立中药天然产物库。第二部分采用海肾荧光素酶双分子标记技术建立体外Hsp90-Cdc37蛋白交互作用模型,首先对模型是否有效进行了验证,然后对模型中影响蛋白交互作用的参数包括蛋白浓度、反应时间及底物浓度进行了优化,确定了模型反应的最优条件。最后采用此模型对天然产物进行了筛选,共筛选到了4个天然产物可以阻断Hsp90与Cdc37蛋白之间的交互作用。第三部分针对筛选到的4个天然产物进行了体外吸收代谢特性的初步评价,然后对吸收代谢特性良好的天然产物进行了大鼠体内药代动力学研究。在药物筛选的初期,采用体外吸收代谢模型对药物的吸收代谢特性进行初步的评价,及早的排除那些吸收代谢特性较差的候选化合物,避免后续不必要的人力和财力的浪费。本部分采用Caco-2细胞transwell模型及体外肝微粒体代谢模型对筛选到的天然产物的吸收代谢特性进行了初步的评价,然后采用大鼠体内药代动力学实验对吸收代谢特性良好的天然产物进行了药代动力学研究。本课题采用海肾荧光素酶双分子标记技术建立了基于Hsp90-Cdc37蛋白交互作用的天然产物抗胰腺癌筛选方法,可快速靶向筛选出阻断Hsp90-Cdc37蛋白交互作用并起到抗胰腺癌作用的化合物。采用此模型对收集到的天然产物进行了抗胰腺癌筛选,共筛选到了4个天然产物(雷公藤甲素、雷公藤三萜酸A、槲皮素和槐果碱)可以阻断Hsp90-Cdc37之间的相互作用。然后对筛选到的天然产物的吸收代谢特性进行了评价,而吸收代谢特性好的天然产物则进一步进行了体内药代动力研究。本课题建立一套从抗胰腺癌药物快速筛选到吸收代谢评价的快速高效的抗胰腺癌药物筛选方法,可以提高抗胰腺癌药物筛选的靶向性及效率。
【关键词】：天然产物 Hsp90 Cdc37 海肾荧光素酶双分子标记技术 药代动力学 Caco-2细胞 肝微粒体 胰腺癌
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-14
• 前言14-21
• 一、课题背景介绍14-20
• (一) 胰腺癌病症概述14-16
• 1、胰腺癌治疗现状14
• 2、Hsp9014-16
• 3、Cdc3716
• (二) 抗癌药物发现概况16-18
• (三) 药物ADMET研究概况18-20
• 1、药物肠道吸收18-19
• 2、药物代谢19-20
• 二、本课题的研究内容和意义20-21
• (一) 研究内容20
• (二) 研究意义20-21
• 第一章 抗癌中药天然产物库的构建21-23
• 一、引言21-22
• 二、抗癌中药天然产物库的构建22-23
• 第二章 基于Hsp90/Cdc37蛋白交互作用的抗胰腺癌药物筛选模型的构建23-37
• 一、引言23-25
• 二、实验部分25-29
• (一) 材料和试剂25-26
• (二) 感受态细胞的制备26
• (三) 质粒的转化26-27
• (四) 蛋白表达27
• (五) 蛋白纯化27-28
• 1、蛋白的诱导表达27
• 2、装柱27-28
• 3、金属螯合亲和柱纯化28
• 4、浓缩和脱盐28
• 5、蛋白浓度测定28
• (六) 荧光实验28
• (七) 影响荧光强度的参数的优化28-29
• (八) 模型的验证29
• (九) 天然产物的筛选29
• 三、结果与讨论29-36
• (一) 蛋白表达29-31
• (二) 蛋白纯化31-32
• (三) 荧光强度参数的优化32-34
• 1、蛋白浓度的优化32-33
• 2、结合时间的优化33-34
• 3、底物浓度的优化34
• (四) 模型的验证34-35
• (五) 天然产物的筛选35-36
• 四、本章小结36-37
• 第三章 药物体外吸收代谢特性及体内药代动力学研究37-54
• 一、引言37-38
• 二、实验部分38-47
• (一) 材料和试剂38-39
• (二) 仪器与分析条件39-42
• (三) Caco-2细胞模型吸收测定42-44
• 1、细胞培养42
• 2、细胞毒性实验42
• 3、转运实验42
• 4、样品处理42-43
• 5、标曲和质控样品的制备43
• 6、数据分析43-44
• (四) 大鼠肝微粒体代谢稳定性考察44-45
• 1、实验方法44
• 2、标曲和质控样品的制备44-45
• 3、数据分析45
• (五) 雷公藤甲素大鼠体内药代动力学研究45-47
• 1、仪器与分析条件45
• 2、实验动物45
• 3、实验方法45-46
• 4、血浆样品前处理方法46
• 5、标曲和质控样品的制备46
• 6、方法学验证46-47
• (1) 选择性考察46
• (2) 线性及最低定量限46
• (3) 准确度及精密度46-47
• (4) 提取回收率及基质效应47
• (5) 稳定性47
• 7、数据分析47
• 三、结果与讨论47-53
• (一) Caco-2细胞模型的吸收测定47-48
• (二) 代谢稳定性考察48
• (三) 雷公藤甲素药代动力学研究48-53
• 1、色谱与质谱条件48-50
• 2、方法学考察50-52
• 3、药动学实验52-53
• 四、本章小结53-54
• 附录54-86
• 参考文献86-102
• 在读硕士学位期间发表论文102-103
• 致谢103

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本文编号：358155