重组人神经生长因子的真核表达及初步活性鉴定

发布时间：2017-05-20 05:05

  本文关键词：重组人神经生长因子的真核表达及初步活性鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)是神经营养因子中最早被发现的、且至今研究最为清楚的一种神经细胞生长调节因子,该因子具有营养神经元和促进突起生长等多种生物学功能。而且近年研究发现,NGF不仅局限于中枢以及周围神经系统,还在褥疮、角膜溃疡、青光眼,甚至在免疫性疾病的治疗中发挥着积极的作用。目前临床上应用最广泛的是鼠源性NGF,然而其生产方法和成品的缺点不容忽视,易引起过敏反应及诱发中和抗体反应;可能被病毒污染;工艺复杂,无法实现自动化,生产成本高,且成药价格高居不下,这引起我们的关注。另一方面,尽管研究者们尝试通过多种方法和从不同系统中利用重组药物技术生产重组人NGFβ亚基(rh-β-NGF),但是采用原核表达系统或者与人类物种差异很大的昆虫系统,难以得到高生物学活性的重组NGF。即便采用真核表达系统,由于缺乏重组载体构建的完备性,导致生产效率相对低下。因此,我们尝试构建一种高效稳定的重组人NGF真核表达载体,通过增加一些转录及翻译调控元件、更换信号肽序列,并检测人NGF的表达水平并鉴定其生物学活性,为大规模生产NGF奠定基础。1、成功建立高效、稳定的重组人NGF的真核表达系统及纯化其表达产物首先,构建重组质粒p CMV-β-NGF-IRES-dhfr,由5部分组成,包括CMV启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列(IRES)和筛选标记基因(Dihydrofolate Reductase,dhfr)。然后将重组质粒转染至HEK293细胞系,用MTX筛选和有限稀释法进行克隆选择,获得高效表达rh NGF的单克隆重组细胞株。结果显示,重组细胞在形态上与普通HEK293细胞相同,生长方式、速度和凋亡率与重组前相似,两者无明显不同。随后逐步降低血清培养,最终使细胞株完全适应无血清培养基,并稳定表达rh NGF(即rh-β-NGF,本文中rh NGF均指rh-β-NGF)。利用SDS-PAGE分析表达产物,可见相对分子质量约13 k Da的条带,纯度大于50%,经质谱法测定得到其肽图谱与理论序列完全匹配,接着我们利用SP Sepharose FF强阳离子层析柱纯化rh NGF,得到rh NGF蛋白纯度95%;最后进行重组细胞株表达效率和表达稳定性检测,结果表明重组细胞株经历60次传代后仍能稳定生长,并高效表达rh NGF,分泌效率为50-100 mg/L培养基上清,约为20-50 pg/(cell?d)。2、重组人NGF经初步鉴定发现具有多方面活性良好生物学活性的rh NGF才具临床药用价值,因此我们通过分析rh NGF对PC12细胞分化、鸡胚背根神经节细胞和小鼠鼠颈上神经节生长的影响,以及经rh NGF处理后小鼠体内一系列指标的变化,来鉴定其生物学活性。大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞(PC12细胞)系,是一类具有神经内分泌特性的细胞系,培养简单,传代方便,因而被广泛应用于神经药理和神经生理学相关领域研究[1,2],诱导PC12细胞分化是检测NGF生物学活性的经典方法。我们常规培养PC12细胞,至其生长至90%单层时,按终浓度5μg/m L加入鼠源性神经生长因子(m NGF)和rh NGF,并以PBS做阴性对照,结果发现rh NGF组较阴性对照组能生长出更多纤维状突起,说明重组细胞株所分泌的rh NGF具有诱导PC12细胞分化的生物学活性活性。鸡胚背根神经节(Dorsal Root Ganglia,DRG)细胞增殖实验是检测神经营养物质的主要方法,也是鉴定NGF生物学活性的常用实验。我们解剖出8 d龄鸡胚的DRG,放置培养皿中培养,待神经节细胞贴壁生长,换入新鲜培养液,加入PBS、m NGF、rh NGF,观察细胞生长情况。24 h各组均有细胞迁出,而48 h后rh NGF组更多细胞的迁出,并形成类神经突起,m NGF组同样也有明显改变,迁出细胞长势良好,而在PBS组中DRG细胞生长明显杂乱无序,且可见凋亡现象。这些结果表明m NGF、rh NGF有神经元营养和促神经细胞生长的作用。进一步检测rhNGF对新生小鼠皮肤Trk A表达水平,以及颈上神经节生长的影响,分析其生物学活性。通过颈部皮肤注射rh NGF,利用Western Blot法检测新生小鼠颈部皮肤Trk A表达量。结果发现,rh NGF与m NGF均能够明显升高小鼠颈部皮肤Trk A表达量,且效果相似。同时,双侧颈部皮肤Trk A表达水平均出现升高,但没有统计学差异,提示rh NGF不仅在注射部位发挥作用,也能够上调远离注射部位皮肤的Trk A,因此rhNGF能够在全身发挥作用。肥大细胞可分泌神经生长因子,后者与肥大细胞膜上NGF受体Trk A结合,通过第二信使Ca2+诱导肥大细胞自身活化并脱颗粒,释放一些炎性介质和组胺等作用于神经末梢促使后者释放神经递质[4,5]。我们通过分析经药物处理后新生鼠皮肤组织的肥大细胞形态,发现rh NGF和m NGF处理的两组,肥大细胞聚集并且脱颗粒,说明rh NGF能与肥大细胞膜上特异受体结合并发挥作用。进一步解剖分离出各组新生鼠颈上神经节(Superior Cervical Ganglia,SCG),于显微镜下测定SCG短径a和长径b,采用1/2×a×a×b的方法计算SCG体积,进行统计学分析。结果发现,注射rh NGF组和m NGF组的SCG对比阴性对照组体积明显增大。分析双侧SCG体积,发现注射rh NGF和m NGF能够同时增加新生鼠双侧SCG体积。通过HE染色对小鼠SCG进行组织学分析,发现两NGF组SCG神经元较之PBS组呈肥大生长且数量增多。综合以上结果,我们建立的细胞株能高效稳定表达rh NGF,并且在体外和体内均具有类似于药用m NGF同样的活性。本研究为rh NGF的临床应用提供研究材料和实验数据。
【关键词】：重组 神经生长因子 真核载体 HEK293细胞 活性鉴定
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R927;R96
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-21
• 1 神经生长因子的临床应用15-18
• 2 神经生长因子的生产方法18-21
• 第一部分 重组人神经生长因子真核表达系统的建立21-35
• 引言21
• 1 主要材料、试剂21-22
• 2 实验方法22-28
• 3 结果28-33
• 4 讨论33-35
• 第二部分 重组人神经生长因子的活性鉴定35-48
• 引言35
• 1 主要材料、试剂35-36
• 2 实验方法36-39
• 3 结果39-45
• 4 讨论45-48
• 小结48-50
• 参考文献50-57
• 个人简历和研究成果57-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 仝进毅;张信美;林俊;;神经生长因子及其受体与子宫内膜异位症疼痛机制[J];国际生殖健康/计划生育杂志;2010年01期

2 叶兰萍;武元元;曹广通;;神经生长因子促进烫伤创面释放内源性生长因子[J];中国组织工程研究;2013年28期

  本文关键词：重组人神经生长因子的真核表达及初步活性鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：380696