人重组精氨酸酶活性的研究

发布时间：2017-05-28 14:09

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【摘要】：精氨酸酶是尿素循环过程中的关键酶,能够催化精氨酸水解。近年来针对癌症治疗有一种新策略即氨基酸剥夺。精氨酸对正常细胞来说是非必需氨基酸,但对肿瘤细胞来说却是必需氨基酸。因此精氨酸酶能够通过消耗精氨酸来阻断肿瘤细胞获得所必需的营养,从而阻碍癌细胞的发育生长,同时对正常细胞几乎无影响,所以精氨酸酶有非常好的应用价值。因此越来越多的人开始关注精氨酸酶的研究。过去对精氨酸酶的研究主要集中在了其抑制剂的研究上,而激活剂研究方面并不多见。基于通过氨基酸剥夺来抑制肿瘤细胞这一机理,更应该加强对精氨酸酶激活剂的研究。以往的研究多集中于精氨酸酶Ⅰ,而且对其研究也多集中于活性口袋。本文针对以往较少研究的精氨酸酶激活剂,聚乙二醇化精氨酸酶Ⅰ进行了探究。定点突变得到突变型精氨酸酶Ⅰ同时发现了精氨酸酶Ⅰ可能存在一个位于空穴C2的调节位点。1.野生型精氨酸酶Ⅰ与突变型精氨酸酶Ⅰ的研究经过分子动力学模拟以及PCR技术对野生型精氨酸酶Ⅰ进行了定点突变,成功得到了突变型精氨酸酶Ⅰ。相对于野生型精氨酸酶Ⅰ来说,突变型精氨酸酶Ⅰ只是C2空穴容积明显减少,对活性口袋的构象及酶整体的构象没有明显的干扰。根据分子模拟及L-Val对精氨酸酶的抑制作用实验结果可推测,野生型精氨酸酶Ⅰ可能存在一个位于C2空穴内的调节位点,小分子物质可以结合在此位点,从而协同调控酶的活性。DMSO,甘氨酸,阿魏酸和谷氨酸钠对野生型精氨酸酶Ⅰ,突变型精氨酸酶Ⅰ都有激活作用。DMSO对于野生型精氨酸酶Ⅰ和突变型精氨酸酶Ⅰ激活效果最为显著。同时DMSO,甘氨酸,阿魏酸和谷氨酸钠这四种物质对突变型精氨酸酶Ⅰ激活程度均大于对野生型精氨酸酶Ⅰ的激活程度。2.PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ的研究PEG包埋修饰野生型精氨酸酶Ⅰ较为适宜的条件为:温度为4℃,PEG与野生型精氨酸酶Ⅰ的投料比为16:1,包埋1h。PEG修饰蛋白与未修饰蛋白的分离的条件为,CM-52阳离子交换层析,梯度混合洗脱的方式来分离,梯混仪中低浓度一侧是不含Na Cl的p H6.0的20mmol/L PBS,高浓度一侧是含200mmol/L Na Cl的p H6.0的20m M PBS。DMSO,甘氨酸,阿魏酸以及谷氨酸钠对于PEG包埋修饰野生型精氨酸酶Ⅰ都有激活作用,DMSO对于PEG包埋修饰野生型精氨酸酶Ⅰ激活效果最为显著。但是DMSO,甘氨酸,阿魏酸以及谷氨酸钠对PEG包埋修饰野生型精氨酸酶Ⅰ都不如对野生型精氨酸酶Ⅰ的影响显著。本实验设计得到了突变型精氨酸酶Ⅰ,发现精氨酸酶Ⅰ表面可能存在有别于活性口袋的另一个新的调节位点,探究了PEG修饰精氨酸酶Ⅰ以及修饰后分离的条件,同时探究了DMSO,甘氨酸,阿魏酸以及谷氨酸钠对野生型精氨酸酶Ⅰ,突变型精氨酸酶Ⅰ以及PEG包埋修饰野生型精氨酸酶Ⅰ的激活作用。本研究期望为以精氨酸酶为靶点的药物研究提供新的思路。
【关键词】：精氨酸酶Ⅰ 突变 调节位点 激活作用 聚乙二醇
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R91
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-20
• 1.1 精氨酸酶的分布及性质12-14
• 1.1.1 自然界中精氨酸酶的分布12
• 1.1.2 生物体中精氨酸酶的分布12-13
• 1.1.3 精氨酸酶的性质13-14
• 1.1.4 精氨酸酶缺乏性疾病14
• 1.2 精氨酸酶在癌症治疗方面的作用14-16
• 1.3 精氨酸酶在药物研发及临床应用方面的研究16-17
• 1.3.1 药物研发16-17
• 1.3.2 临床应用方面的研究17
• 1.4 精氨酸酶的激活剂与抑制剂17-18
• 1.4.1 精氨酸酶的激活剂17
• 1.4.2 精氨酸酶的抑制剂17-18
• 1.5 蛋白药物的长效表达18-19
• 1.6 本论文的立题依据及研究意义19-20
• 第2章 野生型精氨酸酶Ⅰ与突变型精氨酸酶Ⅰ的研究20-38
• 2.1 实验材料20-22
• 2.1.1 菌种和质粒20
• 2.1.2 试剂和药品20-21
• 2.1.3 仪器和设备21-22
• 2.2 实验方法22-27
• 2.2.1 野生型精氨酸酶Ⅰ的表达纯化22-23
• 2.2.2 突变型精氨酸酶Ⅰ质粒的构建23-24
• 2.2.3 野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ蛋白含量测定24-25
• 2.2.4 野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ酶活力测定25
• 2.2.5 野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ米氏常数测定25
• 2.2.6 L-Val对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响25-26
• 2.2.7 DMSO对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响26
• 2.2.8 甘氨酸对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响26
• 2.2.9 阿魏酸对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响26
• 2.2.10 谷氨酸钠对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响26-27
• 2.3 结果与讨论27-36
• 2.3.1 野生型精氨酸酶Ⅰ的表达纯化27-28
• 2.3.2 野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ的分子动力学模拟28-30
• 2.3.3 突变型精氨酸酶Ⅰ的表达纯化30-31
• 2.3.4 L-Val对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响31-33
• 2.3.5 DMSO对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响33
• 2.3.6 甘氨酸对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响33-34
• 2.3.7 阿魏酸对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响34-35
• 2.3.8 谷氨酸钠对野生型与突变型精氨酸酶Ⅰ活性的影响35-36
• 2.4 小结36-38
• 第3章 PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ的研究38-48
• 3.1 实验材料38
• 3.2 实验方法38-40
• 3.2.1 PEG包埋修饰野生型精氨酸酶Ⅰ的条件探索38
• 3.2.2 PEG修饰蛋白与未修饰蛋白的分离38-39
• 3.2.3 PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ蛋白含量测定39
• 3.2.4 PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ酶活力测定39
• 3.2.5 PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ米氏常数测定39
• 3.2.6 DMSO对PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影响39
• 3.2.7 甘氨酸对PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影响39-40
• 3.2.8 阿魏酸对PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影响40
• 3.2.9 谷氨酸钠对PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影响40
• 3.3 结果与讨论40-46
• 3.3.1 PEG包埋修饰野生型精氨酸酶Ⅰ的条件探索40-42
• 3.3.2 PEG修饰蛋白与未修饰蛋白的分离42-43
• 3.3.3 DMSO对PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影响43-44
• 3.3.4 甘氨酸对PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影响44-45
• 3.3.5 阿魏酸对PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影响45
• 3.3.6 谷氨酸钠对PEG修饰的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影响45-46
• 3.4 小结46-48
• 第4章 结论48-49
• 参考文献49-56
• 研究生期间所取得的科研成果56-57
• 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：402799