重组人白介素-29变异体在毕赤酵母中的表达及体外抗肿瘤活性初步分析

发布时间：2017-06-05 08:07

  本文关键词：重组人白介素-29变异体在毕赤酵母中的表达及体外抗肿瘤活性初步分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白细胞介素-29(Interleukin-29,IL-29),通过与其受体结合来起始信号转导并发挥生物学效应,由于IL-29与Ⅰ型IFN激活相同的JAK-STAT信号通路,因而两者具有相同的生物学活性:如免疫调节、抗病毒和抗肿瘤等;同时IL-29的受体具有组织分布特异性,其靶细胞有限:如上皮细胞、胃肠细胞和肝细胞等,因而其可以有效地降低毒副作用。这些发现表明,IL-29有望成为替代IFN-α用于治疗病毒感染和肿瘤的具有临床疗效高且副作用小特性的新型干扰素类药物。通过分析IL-29的三级结构并将其与IL-28B的晶体结构进行比对,发现在h IL-29的空间构象中的螺旋A和F中的4个氨基酸残基(Lys-33、Arg-35、Lys-43和Ala-143)是影响其抗肿瘤活性的关键位点。通过结合自由能和疏水性的分析,选取Lys-33和Arg-35这两个位点进行定点改造,最终构建3个h IL-29变异体。利用大引物PCR方法扩增出h IL-29变异体成熟肽基因(h IL-29mut),经一系列质粒构建、转化以及筛选的步骤后,最终获得毕赤酵母高产h IL-29mut菌株;经酵母基因组鉴定、SDS-PAGE和Western Blotting分析,成功获得GS115/p PIC9KM-h IL-29mut工程菌株。通过正交试验的方法,获得最佳的诱导条件:BMMY初始p H值为7.0、甲醇添加量为1.5%、在26℃条件下诱导60小时。在此条件下进行诱导表达,其发酵上清的A450值达1.778,是诱导优化前发酵上清A450值的1.81倍。对发酵产物进行一系列分离纯化,纯化后的重组蛋白rh IL-29mut(K33R、R35K和K33R/R35K)的HPLC纯度分别为98.59%,97.62%和98.12%。初步的抗肿瘤活性分析表明,三者对BEL-7402、HCT-8和SGC-7901细胞增殖均有良好的抑制作用,且其增殖抑制效果优于野生型的rh IL-29。在这3个获得的重组蛋白中,K33R/R35K的抗肿瘤细胞增殖作用最为显著,在高剂量组(1000 ng/m L)给药条件下,对上述三株肿瘤细胞的抑制率分别为40.09±2.81%,38.11±2.67%和29.31±2.14%。
【关键词】：人白细胞介素-29 定点突变 克隆表达 分离纯化 抗增殖活性
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 绪论8-17
• 1.1 IFN-λs的概况8
• 1.2 白细胞介素-29 的基因构成8
• 1.3 白细胞介素-29 的蛋白质结构8-10
• 1.4 白细胞介素-29 的来源和表达10-11
• 1.5 白细胞介素-29 的受体和靶细胞11
• 1.6 白细胞介素-29 的信号传导11-13
• 1.7 白细胞介素-29 的生物学活性13-14
• 1.7.1 白细胞介素-29 的抗病毒活性13
• 1.7.2 白细胞介素-29 的抗增殖活性13-14
• 1.7.3 白细胞介素-29 免疫调节活性14
• 1.8 白细胞介素-29 的克隆表达和应用14-15
• 1.9 立题意义和主要内容15-17
• 1.9.1 立题意义15
• 1.9.2 主要内容15-17
• 第二章 人白介素-29 变异体基因（hIL-29mut）的克隆表达17-40
• 2.1 引言17
• 2.2 实验材料17-19
• 2.2.1 质粒与菌株17
• 2.2.2 主要试剂17
• 2.2.3 主要仪器17-18
• 2.2.4 常用试剂的配制18
• 2.2.5 培养基18-19
• 2.3 实验方法19-29
• 2.3.1 hIL-29 变异体突变位点的确定19
• 2.3.2 引物的设计与合成19-20
• 2.3.3 hIL-29 变异体成熟肽基因的扩增20-21
• 2.3.4 重组克隆载体pUCm-T-hIL-29mut的构建21-22
• 2.3.5 重组表达载体pPIC9KM-hIL-29mut的构建22-24
• 2.3.6 毕赤酵母的转化24
• 2.3.7 重组毕赤酵母转化子的筛选24-26
• 2.3.8 重组毕赤酵母转化子的鉴定26
• 2.3.9 重组毕赤酵母的诱导条件优化26-27
• 2.3.10 重组蛋白rhIL-29mut的分离纯化27-29
• 2.4 结果与讨论29-40
• 2.4.1 hIL-29 变异体突变位点的确定29-31
• 2.4.2 hIL-29 变异体成熟肽基因的扩增31-32
• 2.4.3 重组克隆载体pUCm-T-hIL-29mut的构建32
• 2.4.4 重组表达载体pPIC9KM-hIL-29mut的构建32-33
• 2.4.5 重组毕赤酵母菌株的筛选33
• 2.4.6 重组毕赤酵母转化子的鉴定33-34
• 2.4.7 重组毕赤酵母的诱导条件优化34-37
• 2.4.8 重组蛋白rhIL-29mut的分离纯化37-40
• 第三章 人白介素-29 变异体（rhIL-29mut）的抗肿瘤活性分析40-47
• 3.1 引言40
• 3.2 实验材料40-41
• 3.2.1 细胞株40
• 3.2.2 主要试剂40
• 3.2.3 主要仪器40-41
• 3.3 实验方法41-42
• 3.3.1 细胞的复苏41
• 3.3.2 细胞的消化41
• 3.3.3 细胞的传代培养41
• 3.3.4 细胞计数41-42
• 3.3.5 细胞冻存42
• 3.3.6 抗肿瘤活性的测定42
• 3.4 结果与讨论42-47
• 3.4.1 rhIL-29mut对BEL-7402 细胞的抗肿瘤作用42-44
• 3.4.2 rhIL-29mut对HCT-8 细胞的抗肿瘤作用44-45
• 3.4.3 rhIL-29mut对SGC-7901 细胞的抗肿瘤作用45-47
• 主要结论与展望47-49
• 主要结论47-48
• 展望48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-55
• 附录A:作者在攻读硕士学位期间发表的论文55-56
• 附录B:重组变异体蛋白的分离纯化结果56-57
• 附录C:Cell Counting Kit-8 试剂盒说明书57-58

【参考文献】

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