蚓激酶活性及蛋白成分的研究

发布时间：2017-06-16 07:08

  本文关键词：蚓激酶活性及蛋白成分的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蚓激酶(Lumbrokinase,LK)又称蚯蚓纤溶酶,是一类来源于蚯蚓的具有纤溶活性蛋白酶的总称。自1983年日本学者Mihara等从粉正蚓中分离到6种具有纤溶活性的蛋白质以来,许多学者对蚓激酶进行了系统的研究。文献报道蚓激酶的主要成分是一组来源于蚯蚓的丝氨酸蛋白酶,包括纤维蛋白溶酶、纤维蛋白溶酶原激活物以及类似组织型纤维蛋白溶酶原激活物等。但蚓激酶在国外均没有作为药品上市。我国于1992年上市,临床应用于缺血性脑血管病中纤维蛋白原增高及血小板凝集率增高的患者。全国有5家生产企业生产蚓激酶原料及肠溶制剂,其生产原料均来源于人工养殖的赤子爱胜蚓(Eisenia fetida),生产工艺简单粗放。蚓激酶作为我国特有的一种酶类生化药物,在临床上应用广泛,疗效好。但是,由于其前期研究基础不足,产品的有效成分、活性研究、控制方法等均比较薄弱,有必要采用现代分析技术对产品中存在的问题深入研究,从而对产品的质量和安全性提升提供现代科学依据。为此,本文采用质谱、酶谱、亲和层析、离子交换层析、纤维平板量反应平行线法等手段,对蚓激酶的成分组成、化学结构、生物活性、质量控制方法等进行了系统研究。本文重点从三个方面对蚓激酶进行研究。蚓激酶组成成分研究采用胰凝乳蛋白酶酶解、LC-MS分离测定、Protein Lynx Global Server 3.0软件分析,结果显示我国该品种的五家生产企业产品中主要存在15种蛋白质,包括4种溶纤酶与10种激酶。其中纤溶酶在每个生产企业的样品中均有检出,一致性较好。蚓激酶国家标准物质中检出5种与溶纤活性相关的蛋白质,包括2种纤溶酶与3种激酶。该研究表明国产蚓激酶原料药中存在蚓激酶活性蛋白成分,存在与溶纤活性相关的蛋白质组分。蚓激酶活性研究重点研究了总活性定量和活性成分识别。对蚓激酶直接纤溶活性及间接纤溶活性进行研究,结果显示蚓激酶不仅具有直接降解纤维蛋白的功能,还有激活纤维蛋白溶酶原起到间接溶解纤维蛋白的功能。基于蚓激酶的生物学活性及传统效价测定方法的局限,引入了生物统计方法——量反应平行线法测定蚓激酶效价。结果显示蚓激酶原料药及标准品均符合量反应平行线法统计学要求,该法更适用于蚓激酶的生物学活性测定。基于蚓激酶直接降解纤维蛋白的特点,建立测定蚓激酶活性蛋白成分的纤溶酶谱法。结果显示纤溶酶谱法能够清晰的显示蚓激酶活性蛋白的存在,并且能够作为评价蚓激酶生产工艺稳定性的一种有效的手段。蚓激酶活性蛋白分离纯化基于前期初步质谱鉴定结果及酶学活性,尝试找到蚓激酶单一活性蛋白。将蚓激酶通过DEAE阴离子交换层析及亲和色谱层析纯化,得到一组有三个蚓激酶活性蛋白的混合物,经质谱鉴定,三个活性蛋白成分为纤溶蛋白酶1、蚓激酶F238及蚓激酶3/5,与初步结果一致。
【关键词】：蚓激酶 酶谱法 液质联用 阴离子交换 亲和层析
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 英文缩略语11-12
• 前言12-14
• 第一部分 蚓激酶组成成分研究14-25
• 1 仪器与材料14-15
• 1.1 实验仪器14
• 1.2 实验材料14-15
• 1.3 主要试剂的配制15
• 2 实验方法15-18
• 2.1 胰凝乳蛋白酶酶解蚓激酶原料药15-16
• 2.2 UPLC-ESI-Q-TOF测定蚓激酶总离子流图16-17
• 2.3 数据处理及分析17-18
• 3 实验结果18-24
• 3.1 蚓激酶原料药与标准品LC-MS总离子流图18-19
• 3.2 蚓激酶原料药与标准品质谱鉴定结果19-24
• 4 讨论与小结24-25
• 第二部分 蚓激酶酶学活性研究25-58
• 1 仪器与材料25-29
• 1.1 实验仪器25-26
• 1.2 实验材料26
• 1.3 主要试剂的配制26-29
• 2 实验方法29-34
• 2.1 蚓激酶纤维蛋白溶酶活性的研究29-30
• 2.2 纤维蛋白溶酶原激酶活性研究30-31
• 2.3 量反应双平行线法测定蚓激酶效价31-32
• 2.4 纤溶酶谱32
• 2.5 凝血时间法32-34
• 3 实验结果34-56
• 3.1 蚓激酶纤溶活性研究结果34-35
• 3.2 蚓激酶激酶活性研究结果35-39
• 3.3 量反应平行线法计算蚓激酶效价39-46
• 3.4 纤溶酶谱法的建立46-50
• 3.5 纤溶酶普法在蚯蚓种属鉴别及生产工艺稳定性评价中的作用50-53
• 3.6 凝血时间法测定效价研究53-56
• 4 讨论与小结56-58
• 第三部分 蚓激酶分离纯化研究58-76
• 1 仪器与材料58-62
• 1.1 实验仪器58
• 1.2 试剂材料58-59
• 1.3 主要试剂的配制59-62
• 2 实验方法62-68
• 2.1 硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、疏水层析62-63
• 2.2 DEAE阴离子交换层析63-64
• 2.3 亲和层析64-65
• 2.4 SDS-PAGE及Fibrin-SDS-PAGE65-66
• 2.5 质谱鉴定目的蛋白66-68
• 3 实验结果68-75
• 3.1 硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、疏水层析68-71
• 3.2 DEAE纯化蚓激酶活性蛋白71-73
• 3.3 Benzamidine亲和层析73
• 3.4 质谱分析数据处理73-75
• 4 讨论与小结75-76
• 结语76-77
• 文献综述77-85
• 参考文献85-89
• 附录189-90
• 附录290-91
• 致谢91

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 闫双银,候婷婷,王丽芳;蚓激酶最新临床应用进展[J];中国药事;2005年06期

2 施媚,何执中;蚓激酶及其分子生物学[J];药物生物技术;2005年03期

3 刘殿峰;张嘉保;张守峰;姚伟;张锐;陈健;文力正;袁宝;扈荣良;;蚓激酶在牛乳腺中的稳定表达[J];中国生物制品学杂志;2007年12期

4 纪红蕊;;蚓激酶最新研究进展[J];亚太传统医药;2009年11期

5 王光明;欧阳卓志;李革;曾耀辉;邱丽玲;;蚓激酶主要药效的实验研究[J];现代应用药学;1990年05期

6 朱燕,何执中,孙可迪,王少飞;蚓激酶对实验性血栓的影响[J];中国药科大学学报;2000年01期

7 凌霄;蚓激酶治疗急性缺血性脑血管病临床观察[J];河北医学;2000年09期

8 从玉文,刘耀明,陈家佩;蚓激酶的研究进展[J];中国生化药物杂志;2000年03期

9 郭怀芳,何执中,张莉;蚓激酶的临床应用进展[J];药物生物技术;2002年01期

10 林铃,何执中;蚓激酶的分离纯化和对大鼠脑血栓模型的药效观察[J];药物生物技术;2004年04期

中国重要会议论文全文数据库 前6条

1 王华光;龙江;王玲;杨宝峰;;蚓激酶对脑缺血的保护作用[A];中国病理生理学会动脉粥样硬化专业委员会五届一次会议论文集[C];2002年

2 吴勇飞;;蚓激酶对实验动物兔脑循环的影响[A];浙江省中西医结合学会神经内科专业委员会第五次学术研讨会中西医结合神经内科学习班资料汇编[C];2006年

3 孙云霞;张雪琳;李军;彭霞;李英;左从林;;注射用蚓激酶-Ⅰ单次静脉给予Beagle犬的毒性试验[A];中国药理学会毒理专业委员会第十次学术会议论文摘要汇编[C];2004年

4 杨俊彦;谢江文;赵菊芳;颜政;毛玲群;闻绍云;王云玲;黄睿;;巴曲酶与蚓激酶联用序贯疗法降纤治疗急性脑梗死[A];2006年浙江省神经病学学术年会论文汇编[C];2006年

5 周兴;张居农;;蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK~R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达[A];中国奶牛协会2007年会论文集（上册）[C];2007年

6 祁威;于晓波;赵亚力;;蚓激酶对老年冠心病患者血液流变性的影响[A];迎接新世纪——2000年全国微循环与血液流变学学术研讨会论文汇编[C];2000年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 李雪墨;百奥药业建设国家蚓激酶生产基地[N];医药经济报;2004年

2 驻京记者 李雪墨 通讯员 李兴发;打造中国生物制药第一品牌[N];医药经济报;2003年

3 驻京记者 李雪墨;把小蚯蚓做成大产业[N];医药经济报;2004年

4 本报记者 缪 舢;侯全民：收回拳头是为了更勇猛的出击[N];中国企业报;2005年

5 本报记者 江沂;更开放 更环保 更高效[N];医药经济报;2005年

6 李斌;我国率先测定“蚓激酶”三维结构[N];人民日报海外版;2003年

7 驻京记者 李雪墨;百奥蚓激酶被列入《中国脑血管病防治指南》推荐用药[N];医药经济报;2004年

8 李斌;我国率先测定“蚓激酶”三维结构[N];医药经济报;2003年

9 ;肝素类一骥领先 蚓激酶低价取胜[N];医药经济报;2004年

10 ;侯全民：百奥现在还远不到平台期[N];医药经济报;2004年

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 宋文龄;基因工程蚓激酶的高效表达及生物活性检测[D];吉林大学;2007年

2 卜秀娟;蚓激酶表达产物活性在动物体内的检测[D];吉林大学;2007年

3 严伟;蚓激酶肠溶微囊的制备及评价体系的研究[D];成都中医药大学;2003年

4 范志强;蚓激酶基因在山羊乳腺中的表达及转基因小鼠的制备[D];中国医科大学;2005年

5 刘殿峰;蚓激酶基因在牛乳腺中的表达及其转基因兔的建立[D];吉林大学;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 佘启锋;水葫芦的高值化利用及其生态治理[D];福州大学;2014年

2 彭鑫;蚓激酶活性及蛋白成分的研究[D];湖北中医药大学;2016年

3 周海;蚓激酶的提取纯化、酶学性质及抗血栓效果研究[D];武汉工业学院;2010年

4 余玲俐;蚓激酶抗肿瘤作用及机制研究[D];广东药学院;2013年

5 谢德芳;蚓激酶的分离纯化、酶学性质及体外模拟消化的研究[D];武汉轻工大学;2013年

6 郑慧;蚓激酶提取分离工艺的研究[D];山西医科大学;2014年

7 刘

本文编号：454728