模拟失重对肺微血管内皮细胞的影响

发布时间：2017-07-20 06:00

  本文关键词：模拟失重对肺微血管内皮细胞的影响

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【摘要】： 失重或模拟失重可导致肺循环功能失调,血管结构、功能的变化在其中具有重要作用。肺微血管内皮细胞功能对于肺循环的正常功能维持具有重要作用,是构成微血管通透性的主要物理屏障,不仅能保证微血管内外正常的物质交换,而且可分泌多种因子调节微血管的舒缩功能。失重或模拟失重后肺微血管内皮细胞结构、功能变化及其内在机制并不清楚。因此,本课题的目的为： (1)观察回转模拟失重对肺微血管内皮细胞超微结构的影响； (2)研究回转模拟失重对肺微血管内皮细胞合成NO产量及eNOS蛋白表达的影响； (3)研究回转模拟失重对肺微血管内皮细胞骨架的影响； (4)研究回转模拟失重对肺微血管内皮细胞凋亡的影响初步分子机制。 方法 采用组织块贴壁法培养原代肺微血管内皮细胞,以倒置相差显微镜、Ⅷ因子免疫荧光染色、扫描电镜和透射电镜等方法对培养的肺微血管内皮细胞进行鉴定；采用回转器回转细胞模拟失重,以扫描电镜和透射电镜法对回转模拟失重后肺微血管内皮细胞的超微结构变化进行观察;以Griess法对培养的肺微血管内皮细胞合成释放的NO浓度进行检测,以免疫组化技术和Western blot技术对肺微血管内皮细胞中的eNOS蛋白表达进行检测；以Annexin V-FITC和PI双染标记细胞,采用流式细胞术及Hoechst33258细胞核染色对肺微血管内皮细胞凋亡进行检测：采用免疫荧光标记技术,以Texas Red-X偶联的phalloidin标记肺微血管内皮细胞微丝肌动蛋白,观察回转模拟失重对肺微血管内皮细胞骨架的影响；采用放免技术检测回转模拟失重后肺微血管内皮细胞ET-1合成释放量的变化,以Western blot技术和免疫荧光技术检测肺微血管内皮细胞Akt磷酸化水平的变化及P21Cip1蛋白表达的变化；采用Western blot技术对凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax的表达进行检测。 结果 扫描电镜结果表明,回转48h后,肺微血管内皮细胞单层细胞之间的连接较为松散,可见有明显的裂缝存在；而在同步对照组的肺微血管内皮细胞单层可见细胞之间的连接较为紧密,未见裂缝或空洞存在,说明回转模拟失重能够破坏肺微血管内皮细胞单层,导致肺微血管内皮细胞单层的通透性明显增强。透射电镜结果表明,回转48小时后,可见肺微血管内皮细胞中线粒体增生、肿胀。NO检测及Western blot、免疫组化结果表明,回转模拟失重可导致肺微血管内皮细胞的NO产量增加,同时增强eNOS蛋白的表达,并且这种增加存在时间依赖关系。Hoechst33258染色及流式细胞术检测结果表明,回转48h模拟失重肺微血管内皮细胞凋亡率明显高于对照；phalloidin肺微血管内皮细胞微丝肌动蛋白染色结果表明,回转模拟失重可导致微丝细胞骨架随着回转时间的延长出现进行性的解聚：回转48h后,放免结果表明肺微血管内皮细胞合成释放ET-1的量下降；Western blot及免疫荧光染色结果表明,Akt磷酸化水平下降,而P21Cip1蛋白表达增强;Western blot检测凋亡相关蛋白结果表明,回转模拟失重后肺微血管内皮细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下降,而促凋亡蛋白Bax表达显著升高。 结论 (1)回转模拟失重可导致肺微血管内皮细胞中线粒体增生、肿胀;破坏肺微血管内皮细胞单层,导致肺微血管内皮细胞单层的通透性明显增强； (2)回转模拟失重可刺激肺微血管内皮细胞中NO的合成和释放,增强eNOS蛋白的表达,并且这种eNOS表达的增强和NO产量的增加与回转模拟失重的时间长短呈正相关； (3)回转模拟失重可导致肺微血管内皮细胞发生早期凋亡； (4)回转模拟失重可导致PMVEC内微丝细胞骨架发生解聚; (5)回转模拟失重导致了肺微血管内皮细胞ET-1合成分泌下降及线粒体膜通透性转换孔开放增加；抑制肺微血管内皮细胞中Akt的磷酸化水平,增强P21Cip1蛋白的核内表达水平；抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,增强了促凋亡蛋白Bax的表达。
【关键词】：回转 模拟失重 肺微血管内皮细胞 细胞凋亡 细胞骨架 NO eNOS Akt Bcl-2 Bax P21~(Cipl)
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R855.22
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 参考文献16-19
• 第一部分 肺微血管内皮细胞原代培养、鉴定及超微结构观察19-30
• 1. 材料与方法19-22
• 2. 结果22-27
• 3. 讨论27-29
• 参考文献29-30
• 第二部分 模拟失重对肺微血管内皮细胞eNOS表达及NO产生的影响30-42
• 1. 材料与方法30-36
• 2. 结果36-39
• 3. 讨论39-40
• 参考文献40-42
• 第三部分 模拟失重对肺微血管内皮细胞凋亡的影响42-49
• 1.材料与方法42-44
• 2. 结果44-45
• 3. 讨论45-47
• 参考文献47-49
• 第四部分 模拟失重对肺微血管内皮细胞F-actin的影响49-55
• 1 材料和方法49-50
• 2 结果50-52
• 3 讨论52-54
• 参考文献54-55
• 第五部分 模拟失重下肺微血管内皮细胞凋亡的初步机制研究55-73
• 1. 材料与方法55-61
• 2. 结果61-66
• 3. 讨论66-70
• 参考文献70-73
• 结论73-74
• 文献综述74-82
• 模拟失重对肺血管内皮细胞影响研究进展74-79
• 参考文献79-82
• 博士期间发表的文章82-83
• 致谢83

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：566479