芥子气原型的体内分析新方法及“脂库蓄积”与内源性生物标志物差异的发现

发布时间：2017-07-28 19:30

  本文关键词：芥子气原型的体内分析新方法及“脂库蓄积”与内源性生物标志物差异的发现

  更多相关文章： 衍生化 同位素稀释法 定量分析 毒代动力学 脂库蓄积 代谢组学 脂质组学 高效液相色谱/质谱联用 芥子气 皮肤染毒 尿液 血浆 组织 主成分分析 偏最小二乘法-判别分析 正交信号校正偏最小二乘法-判别分析

【摘要】：芥子气(Sulfur Mustard,美军代号HD)是难防难治化学战剂的代表及外军重点研究的目标化学战剂,是世界现存化学武器的主要填充剂,也是日军在华遗弃化学武器的主要成份。其结构简单,容易合成,恐怖威胁巨大。因此,基于应对化学战、化学恐怖袭击的迫切前提,以及我国所面临的复杂周边战事环境,在目前尚无有效的预防和治疗措施条件下,迫切需要通过新的研究手段来深入阐述芥子气中毒机制。芥子气作为广泛的烷基化试剂而引起多靶点多脏器中毒损伤作用,但传统毒理学研究大多数局限于关注孤立的某些通路或某一个基因、蛋白的变化,因此,迄今为止其具体的毒理作用机制并未完全阐明。本课题首先基于系统毒理学研究思路,冀希在整体层面上探索芥子气的复杂毒理作用。侧重于应用整合代谢组学技术,从不同生物样本层面研究体内处置过程中代谢物组的动态变化趋势,寻找发现芥子气中毒相关的内源性生物标志物,探讨各种机制间的相互联系和作用,以及不同机制间发挥作用的先后顺序与重要程度,提出辅助临床诊断指标和医学干预措施,以期对于芥子气的干预和治疗产生一定的指导作用。芥子气在体内具有反应活性高、代谢速度快等特点,对分析方法的稳定性和灵敏度要求非常高,但经典分析方法在分析生物样本中芥子气原型时存在瓶颈,如气相色谱法分析芥子气存在热不稳定,同位素示踪法无法区分原型与代谢产物,基于胶体金的原子吸收法存在内源性巯基化合物干扰等问题,导致目前芥子气体内处置数据的不确定性。本课题在建立高灵敏度和高稳定性的芥子气原型体内分析新方法基础上,将分析毒理学研究思路应用于芥子气原型在体内吸收、分布等处置过程的分析,深入且清晰地阐明芥子气原型在体内的代谢模式、途径与机制等问题。进而准确把握芥子气在体内的留存方式和时相,对于发现关键毒理作用的靶细胞及靶器官,指导临床干预治疗的位点以及有效时间窗等具有非常重要的意义。具体研究结果如下:(1)损伤内源性生物标志物的发现尿液样本分析结合反相液相色谱质谱联用(RPLC-MS)与亲水作用色谱质谱联用(HILIC-MS)技术,综合运用多种谱图解析手段共鉴定与芥子气相关的内源性生物标志物34个,主要有核酸类代谢产物,如胞嘧啶、脱氧胞苷、脱氧腺苷等;色氨酸及其代谢产物,如黄尿酸、犬尿喹啉酸、葡糖醛酸化吲哚乙酸等;苯丙氨酸及其代谢产物,如阿魏酸、马尿酸等;能量代谢相关代谢产物,如柠檬酸、葡糖酸、胆汁酸盐等;以及一些与食物消化相关的黄酮类化合物,如大豆素与葡糖醛酸化大豆素等。涉及到的体内代谢途径主要包括DNA的损伤修复代谢,炎症相关氨基酸代谢,肠道菌群失衡,糖、脂肪等能量物质代谢,以及II相酶诱导的转化途径(如葡萄糖醛酸化和硫酸酯化)等。血浆样本分析综合运用多种谱图解析技术共鉴定与芥子气相关的极性小分子内源性生物标志物27个,主要有胆汁酸类代谢产物,如胆酸、脱氧胆酸、甘氨酸胆酸等;氨基酸及其代谢产物,如苯丙氨酸、色氨酸、苯乙醇硫酸盐等;能量代谢相关代谢产物,如柠檬酸、尿酸等;以及磷脂类化合物,如溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱等。同时,应用脂质吸附填料特征提取血浆中脂类成分,通过全信息串联质谱分析技术(MSE),鉴定出163种脂类代谢产物,并针对这些脂类化合物进行了靶向脂质组学分析,发现与芥子气代谢相关的甘油三酯亚型、甘油二酯以及磷脂类内源性生物标志物。结合血液生化指标结果和芥子气皮肤染毒大鼠血浆中代谢组(包括小分子极性代谢产物与脂类代谢产物)随时间变化的轨迹,阐述了芥子气与肝脏急性损伤的相关性和物质基础,以及与不饱和脂类代谢产物高度相关的脂质过氧化过程。组织样本分析通过对不同脏器(包括肝、肺、脾、脑和胰腺)在中毒后的代谢轮廓轨迹的分析,探讨了芥子气作用于不同器官时所造成的代谢状态改变的方向和效应。结合肝脏组织极性代谢产物的代谢组学轨迹分析与非极性脂类代谢产物的非靶标脂质组学分析,以及血液生化分析中指征肝功能损伤的转氨酶指标变化趋势等,发现芥子气在6-12 h的潜伏期内就已造成肝脏功能的急性损伤,具体表现为转氨酶的升高,胆汁酸的合成和转运受阻,肝脏代谢酶体系的抑制,溶血性磷脂含量的升高等。肝脏组织实时荧光定量PCR结果也发现了胆汁酸代谢及转运相关关键酶基因的RNA表达水平下调。(2)芥子气原型体内分析新方法及“脂库蓄积”利用芥子气的烷基化反应活性,通过衍生化试剂硫代乙酸钾(PTA)与其发生亲核反应,生成稳定且兼具良好色谱和质谱行为的衍生化产物双乙酰硫基乙硫醚(BTAETE),进而采用同位素稀释法液相色谱质谱联用技术对衍生化产物进行检测,首次实现了对复杂基质样品中芥子气的液相色谱质谱联用方法(LC-MS/MS)进行定性和定量分析。该LC-MS/MS分析方法的运行时间短、回收率高、精密度和重复性良好,尤其是灵敏度和稳定性高于现行经典检测技术(乙腈溶液中的最低定量限达到0.1 ng/m L,而全血中的最低定量限达到0.5 ng/m L),且衍生化方法简便快捷,样品制备与检测分析可在1小时内完成,能有效分离检测复杂基质样品中芥子气原型,成功应用于揭示生物样品中芥子气原型存在的定量分析。通过对芥子气皮肤染毒大鼠体内血液及不同组织中芥子气原型分子的代谢行为研究,结果显示芥子气透皮后迅速进入循环系统并随血液分布到全身脏器,其脂肪组织中的含量要远高于非脂肪脏器(至少15倍),经计算脂肪组织中仅在芥子气达峰时蓄积量就占实际染毒剂量的1.25%,出现了明显的“脂库蓄积”现象,且在较高浓度下能够维持一定时间(消除半衰期为1.3-2 h),与现有体内代谢数据相比,观测分布与消除时相均有所延长;进一步通过毒代动力学分析表明芥子气原型在脂肪组织中1-3h达到平均峰值,达峰后迅速消除,脂肪内平均驻留时间为2.5-5.3 h,同时其含量存在一定的染毒剂量相关性。目前还没有见到针对脂肪组织中芥子气的毒代动力学相关研究报道,本论文应用建立的芥子气原型体内分析新方法首次发现并证明了“脂库蓄积”,并且全面分析了芥子气在生物体内的代谢分布处置全过程。综上分析,芥子气中毒存在非常明显的时程效应和复合效应,在潜伏期主要以DNA的损伤修复、脂质过氧化与肝脏急性损伤等为主;发展期主要表现为过度炎症反应;恢复期则表现为能量反馈代谢。针对芥子气中毒不同时期的多靶点毒性效应,临床诊断指标和医学干预措施应采取分期分型的靶向治疗手段。鉴于“脂库蓄积”的时程分析结论,在早期可结合转氨酶等临床生化指标与DNA损伤标志物等来辅助芥子气中毒的临床诊断,并针对肝脏损伤和清除自由基等方面进行相关医学干预,而在中期则要以抗炎治疗为主,后期需要侧重于能量代谢功能的修复。同时,在中毒早期(3h内)可针对脂肪组织采用脂靶向清除剂,及时干预或阻断芥子气的继发性损伤进程。
【关键词】：衍生化 同位素稀释法 定量分析 毒代动力学 脂库蓄积 代谢组学 脂质组学 高效液相色谱/质谱联用 芥子气 皮肤染毒 尿液 血浆 组织 主成分分析 偏最小二乘法-判别分析 正交信号校正偏最小二乘法-判别分析
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R82;O657.63
【目录】：

• 缩略词表9-11
• 摘要11-14
• ABSTRACT14-18
• 第一章 前言18-40
• 1.1 芥子气中毒机制、体内代谢过程与原型分析方法概述19-23
• 1.1.1 芥子气中毒机制研究19-20
• 1.1.2 芥子气体内分布、代谢与蓄积20-22
• 1.1.3 芥子气原型体内分析方法22-23
• 1.2 基于液相色谱-质谱联用技术的代谢组学研究方法策略23-28
• 1.2.1 代谢组学概述24-25
• 1.2.2 基于LC-MS的代谢组学研究技术25-27
• 1.2.3 脂质组学——代谢组学研究的重要分支27
• 1.2.4 代谢组学及脂质组学在系统毒理学中的应用前景27-28
• 1.3 课题立项背景与意义28-30
• 1.3.1 立项背景28-29
• 1.3.2 研究的必要性29-30
• 1.4 主要工作30-32
• 1.4.1 研究内容30-31
• 1.4.2 研究目标31
• 1.4.3 研究的关键问题31-32
• 参考文献32-40
• 第二章 尿液样本的代谢组学分析40-72
• 2.1 引言40-41
• 2.2 实验材料41-43
• 2.2.1 试剂41-42
• 2.2.2 仪器42
• 2.2.3 实验动物42
• 2.2.4 实验防护42-43
• 2.3 实验方法43-46
• 2.3.1 动物实验43
• 2.3.2 尿液处理43-44
• 2.3.3 LC-MS数据采集44-45
• 2.3.4 数据处理和分析45-46
• 2.4 结果与讨论46-68
• 2.4.1 空白对照组样本分析（数据可靠性分析）46-48
• 2.4.2 代谢轨迹分析48-52
• 2.4.3 内源性生物标志物的筛选和鉴定52-66
• 2.4.4 代谢轮廓的量效分析66-68
• 2.5 结论68
• 参考文献68-72
• 第三章 血浆样本的代谢组学分析72-90
• 3.1 引言72
• 3.2 实验材料72-73
• 3.2.1 试剂72-73
• 3.2.2 仪器73
• 3.2.3 实验动物73
• 3.3 实验方法73-76
• 3.3.1 动物实验73-74
• 3.3.2 血浆生化指标测定与分析74
• 3.3.3 血浆样品处理74-75
• 3.3.4 LC-MS数据采集75-76
• 3.3.5 数据处理和分析76
• 3.4 结果与讨论76-87
• 3.4.1 血液生化指标分析76-78
• 3.4.2 代谢轨迹分析78-83
• 3.4.3 内源性生物标志物分析83-86
• 3.4.4 不同染毒途径代谢轮廓差异分析86-87
• 3.5 结论87
• 参考文献87-90
• 第四章 组织样本的代谢组学分析90-102
• 4.1 引言90
• 4.2 实验材料90-91
• 4.2.1 试剂90-91
• 4.2.2 仪器91
• 4.2.3 实验动物91
• 4.3 实验方法91-94
• 4.3.1 动物实验91-92
• 4.3.2 组织样品处理92
• 4.3.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应92-94
• 4.3.4 LC-MS数据采集94
• 4.3.5 数据处理和分析94
• 4.4 结果与讨论94-99
• 4.4.1. 肝脏组织代谢轮廓分析95-98
• 4.4.2 脾脏组织代谢轮廓分析98
• 4.4.3 肺组织代谢轮廓分析98
• 4.4.4 胰腺组织代谢轮廓分析98
• 4.4.5 肝脏组织胆汁酸盐代谢及转运途径基因表达水平改变98-99
• 4.5 结论99-100
• 参考文献100-102
• 第五章 血浆样本的脂质组学分析102-120
• 5.1 引言102
• 5.2 实验材料102-103
• 5.2.1 试剂102-103
• 5.2.2 仪器103
• 5.2.3 实验动物103
• 5.3 实验方法103-105
• 5.3.1 动物实验103-104
• 5.3.2 血浆样品处理104
• 5.3.3 LC-MS数据采集104-105
• 5.3.4 数据处理和分析105
• 5.4 结果与讨论105-117
• 5.4.1 数据可靠性分析105-107
• 5.4.2 脂类代谢产物的定性分析107-112
• 5.4.3 脂类代谢组学分析112-117
• 5.5 结论117-118
• 参考文献118-120
• 第六章 组织样本的脂质组学分析120-126
• 6.1 引言120
• 6.2 实验材料120-121
• 6.2.1 试剂120
• 6.2.2 仪器120-121
• 6.2.3 实验动物121
• 6.3 实验方法121-122
• 6.3.1 动物实验121
• 6.3.2 组织样品处理121-122
• 6.3.3 LC-MS数据采集122
• 6.3.4 数据处理和分析122
• 6.4 结果与讨论122-124
• 6.4.1. 肝脏组织脂类代谢轮廓分析124
• 6.4.2 脑、脾脏和肺组织脂类代谢轮廓分析124
• 6.4.3 胰腺组织脂类代谢轮廓分析124
• 6.5 结论124-125
• 参考文献125-126
• 第七章 芥子气原型分析方法的建立126-138
• 7.1 引言126-127
• 7.2 实验材料127-128
• 7.2.1 试剂127
• 7.2.2 仪器127-128
• 7.3 实验方法128-131
• 7.3.1 溶液配制与衍生化产物的制备128
• 7.3.2 衍生化反应条件的考察128-129
• 7.3.3 LC-MS/MS条件优化129-130
• 7.3.4 方法学考察130-131
• 7.4 结果与讨论131-136
• 7.4.1 衍生化产物的表征131
• 7.4.2 衍生化条件优化和衍生化效率131-133
• 7.4.3 方法学验证结果133-136
• 7.5 结论136
• 参考文献136-138
• 第八章 大鼠皮肤芥子气染毒后原型检测及“脂库蓄积”138-160
• 8.1 引言138-139
• 8.2 实验材料139-140
• 8.2.1 试剂139
• 8.2.2 仪器139
• 8.2.3 实验动物139-140
• 8.3 实验方法140-144
• 8.3.1 动物实验与溶液配制140-141
• 8.3.2 生物样本处理条件优化141
• 8.3.3 体外染毒实验141-143
• 8.3.4 方法学考察143
• 8.3.5 染毒大鼠体内芥子气原型的检测143-144
• 8.4 结果与讨论144-156
• 8.4.1 脂肪系数检测结果144
• 8.4.2 体外实验结果144-148
• 8.4.3 方法学验证结果148-151
• 8.4.4 染毒大鼠全血中芥子气原型的代谢动力学研究151-153
• 8.4.5 大鼠皮肤染毒体内芥子气原型的代谢行为及“脂库蓄积”153-156
• 8.5 结论156-157
• 参考文献157-160
• 第九章 研究总结与展望160-166
• 9.1 研究工作总结与讨论160-163
• 9.1.1 不同生物样本的代谢组学分析160-161
• 9.1.2 芥子气中毒机制相关性分析161-162
• 9.1.3 芥子气原型分子检测方法建立及应用162-163
• 9.2 论文创新点163-164
• 9.3 展望164-166
• 文献综述166-180
• 参考文献174-180
• 攻读博士学位期间发表学术论文180-181
• 附录 1181-185
• 附录 2185-187
• 致谢18

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本文编号：585708