模拟微重力对K562细胞红系分化及细胞骨架的影响研究

发布时间：2017-08-05 11:32

  本文关键词：模拟微重力对K562细胞红系分化及细胞骨架的影响研究

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【摘要】：研究背景航天飞行会导致人体血液、消化、生殖、心血管、免疫和骨骼等多个器官系统的功能改变。空间环境对人类机体的影响已成为科学领域的研究热点。微重力环境与地球上1 g的重力环境不同,又称零重量,它是空间环境的主要特点之一。研究航天飞行过程中微重力环境对航天员健康的影响,探讨其发生机理及制定有效的防治措施已成为一项迫在眉睫的任务。血红蛋白总量和红细胞数量的减少、红细胞体积的减小早在20世纪就引起了航天医学家们的重视,他们把这种现象称为“航天贫血症”(spaceflight anemia)。目前科学家们尚未能解释这一现象发生的原因,但有研究表明微重力可能是通过影响造血干细胞的分化和凋亡而引起贫血现象。红细胞的生成是一个复杂的过程,包括造血干细胞发育为原成红细胞再进一步分化为成熟红细胞,期间各种细胞转录因子之间相互作用使得这一过程达到稳定状态。转录因子家族中GATA家族和Ets家族在红系分化过程中起着关键的调控作用。GATA家族是含有锌指结构的转录因子家族,其中GATA-1和GATA-2主要分布在肥大细胞、T淋巴细胞、红系和巨核系的细胞中。GATA-1是造血系统特有的转录因子,主要在红系发育晚期表达,为正常红细胞发育所必需,它能激活多种红系分化特有基因,进而诱导细胞向红系分化,并且在细胞向红系分化时表达显著上升。GATA-1表达的增加也是K562细胞向红系分化成熟的一个重要标志。GATA-2则主要在多能的前体细胞中表达,对未成熟的造血细胞的增殖与维持有重要意义。过表达GATA-2会抑制细胞向红系分化,促进其向巨核系分化。Ets家族是转录因子家族中最大的一个家族之一,其中Ets-1在造血系统的调控中扮演着重要角色,它能调控淋巴细胞的生成和NK细胞的发育,在红系分化过程中起负向调控作用。Ets-1可以通过上调GATA-2的表达从而抑制红系分化,同时Ets-1还与GATA-2在红系分化过程中起协同作用。综上,任何一个转录因子表达异常均可能导致造血干/祖细胞红系分化障碍。细胞骨架是微管、中间纤维和微丝组成的纤维状聚合物与细胞膜上黏附斑、细胞间连接等特殊结构相互联系,与各种调控蛋白交错连接,并与细胞核的支架系统相互作用的网络结构。微管由a和p微管蛋白组成,正常时以p二聚体即β-Tubulin形式存在,具有维持细胞形态、辅助细胞内物质运输的功能,在真核细胞的染色体分离中发挥重要作用。中间纤维的化学组成比较复杂,主要由波形蛋白(Vimentin)构成,与核基质相互作用调节核内基因的表达影响细胞分化。微丝是一个实心状的纤维,主要以F-actin多聚体形式存在,是迁移的主要驱动力,在细胞的运动过程中起了重要的作用。细胞骨架是外力发挥作用和细胞转导应力刺激的结构基础,细胞可以通过细胞骨架感受重力通过物理和化学信号途径传导的力学信号。细胞骨架是非常活跃的系统,它的单体和聚合体之间可以相互转化发生改变,正是这种动态结构使得细胞骨架在感知微重力上发挥了重要作用。细胞的骨架蛋白表达异常会导致细胞骨架受损可影响细胞的正常形态和功能。微重力条件下细胞膜蛋白感受微重力所致的细胞骨架的变化可以激活ERK、P38和JNK等下游的一系列信号转导途径,影响核内转录因子及jun、c-fos等基因的表达进而影响细胞的增殖、分化及凋亡过程。研究发现干细胞分化的改变机制与细胞骨架的改变有关。综上,细胞骨架中任何组分发生异常导致细胞骨架破坏均可能影响细胞的增殖、分化、凋亡。因此,本实验即通过检测K562细胞的分化、相关转录因子的表达及细胞骨架的表达情况研究模拟微重力对K562细胞分化的影响及可能机制。研究者目前通过航天空间站和地面模型两种方式获得微重力来进行相关的生命科学研究。由于空间研究机会少、实验周期长、费用昂贵不能广泛的应用于实验。地面微重力研究主要应用小鼠尾吊模型及微重力效应模拟装置进行各种实验。旋转细胞培养系统(Rotary cell culture system,RCCS)是目前公认的地面微重力效应模拟培养装置,其所得实验结果和真实微重力下实验结果有很好的相关性,可以用来行微重力相关实验的研究。本实验使用第四代RCCS(RCCS-4)模拟微重力环境,观察该环境下K562细胞红系分化的情况并探索其可能机制。K562细胞株是具有向终末红系、巨核细胞和巨噬细胞系等多向分化潜能的人红白血病细胞。由于造血干细胞获取困难、培养周期较长,K562细胞株已经被广泛地应用于红系分化研究模型中。氯化高铁血红素(Hemin)是常见的红系分化诱导剂,可以诱导红系祖细胞和K562细胞内血红蛋白的合成。研究目的本实验旨在研究模拟微重力对K562细胞红系分化的影响以进一步探究“航天贫血症”发生的可能机制。研究方法本实验采用第四代旋转细胞培养系统(RCCS-4)模拟微重力环境,采用人红白血病来源的K562细胞株作为造血干／祖细胞模型。实验分为两部分,第一部分实验采用Hemin作为K562细胞红系分化的诱导剂,将实验分为正常重力(normal gravity)培养组(NG组),Hemin诱导组(Hemin组),模拟微重力(simulated microgravity)培养组(SMG组)和模拟微重力下Hemin诱导组(Hemin+SMG组).培养K562细胞48h后采用联苯胺染色法观察四种培养条件下K562细胞内血红蛋白的表达情况；分别培养K562细胞6h、12h、24h、48h 后采用实时荧光定量 PCR(Reverse Transcriptase-quantitative PCR,RT-qPCR)法检测四种培养条件下红系分化相关转录因子GATA-1、GATA-2和Ets-1的nRNA表达水平。第二部分实验分为NG组和SMG组,培养K562细胞24h后采用间接免疫荧光法观察两种培养条件下K562细胞骨架蛋白F-actin.p-Tubulin和Vimentin的荧光强度；采用RT-qPCR法检测6h.12h.24h.48h细胞骨架F-actin.p-Tubulin和Vimentin的nRNA表达水平；、Vestern blot法检测12h、24h细胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的蛋白表达水平。本研究不同时间点之间无相关性,为独立重复实验,每组实验重复3次。数据分析采用SPSS20.0软件,计量资料以均数士标准差表示,采用两样本t检验及ANOVA法分析比较,P0.05有统计学差异。研究结果(1) Hemin组联苯胺染色阳性率明显高于NG组,SMG+Hemin组联苯胺染色阳性率显著低于Hemin组。(2) Hemin处理K562细胞后,GATA-1基因表达水平在12h后升高,GATA-2基因表达水平在12h后降低,Ets-1基因表达水平在6h即出现明显降低；模拟微重力处理K562细胞后,GATA-1基因表达水平在24h后明显降低,GATA-2基因表达水平在12h后升高,Ets-1基因表达水平在24h后出现明显升高；模拟微重力和H emin共同处理的K562细胞与单纯Hemin诱导细胞比较,GATA-1基因表达水平在24h后降低,GATA-2基因表达水平无明显改变,Ets-1基因表达水平在24h后出现升高。(3)模拟微重力处理K562细胞后,F-actin、β-Tubulin和Vimentin的荧光强度较NG组均明显减弱。(4)SMG组细胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的基因表达水平在12h和24h均较NG组减少,6h和48h无明显改变。(5)SMG组细胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的蛋白表达水平在12h和24h均较NG组减少。结论模拟微重力可以抑制K562细胞红系分化。其机制可能为模拟微重力使对重力敏感的细胞骨架表达发生下调,微丝、微管解聚,中间纤维断裂,细胞骨架破坏,影响转录因子G ATA-1、GATA-2、Ets-1的基因表达。
【关键词】：模拟微重力 航天性贫血 K562细胞 细胞骨架 分化 转录因子
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R852.22
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-15
• 前言15-20
• 1. 微重力与模拟微重力15-16
• 2. 红系分化与调控16-17
• 3. 细胞骨架17-18
• 4. 微重力对细胞影响的研究现状18-20
• 第一部分 模拟微重力对K562细胞红系分化的影响20-35
• 1.1 实验材料21-22
• 1.2 实验方法22-27
• 1.3 实验结果27-33
• 1.4 讨论33-35
• 第二部分 模拟微重力对K562细胞细胞骨架的影响35-56
• 2.1 实验材料36-39
• 2.2 实验方法39-46
• 2.3 实验结果46-53
• 2.4 讨论53-56
• 全文总结56-59
• 参考文献59-66
• 攻读学位期间成果66-67
• 致谢67-69

【共引文献】

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本文编号：624690