中药单体氧化苦参碱延缓骨性关节炎骨-软骨退变的分子机制研究

发布时间：2020-03-19 18:57

【摘要】：背景和目的骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种慢性退行性疾病,其关节软骨和软骨下骨都经历了复杂的的重塑过程。关节软骨细胞肥大、凋亡,软骨退变。同时由破骨细胞介导的软骨下骨丢失,导致表层关节软骨支撑缺失,加速其退变。氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)是一种天然小分子化合物,深入探索其对于OA软退变及软骨下骨重塑的作用,有望为OA的治疗提供新的药物选择,具有重要的价值。内容和方法1.Real-time PCR研究OMT对于软骨细胞炎症因子和基质金属蛋白酶的变化。ELISA检测炎症因子和基质金属蛋白酶的分泌情况。并通过离体软骨组织培养,研究OMT对于离体培养软骨组织退变的挽救作用。2.研究OMT在调节成骨、破骨细胞分化成熟中的作用。TRAP染色和F-Actin环形成实验检测破骨细胞分化情况。Real-time PCR和western blot研究OMT对于破骨细胞分化标致基因表达的影响。3.研究OMT对于NF-κB信号通路及MAPK信号通路的激活的影响。4.通过构建ACLT骨关节炎模型,应用组织形态学和生物学分析手段,深入研究腹腔注射OMT对ACLT小鼠的骨丢失的保护作用及对于软骨退变的延缓作用。结果1.Real-time PCR结果表明,OMT预处理可以显著降低由脂多糖诱发的炎症因子和基质金属蛋白酶的产生。ELISA进一步验证了上述结果。离体培养软骨组织的免疫组化染色结果显示,OMT显著抑制软骨组织释放蛋白聚糖,对关节软骨具有显著的保护作用。2.TRAP染色和F-Actin染色结果显示OMT可以抑制破骨细胞的分化成熟。Real-time PCR和western blot结果显示OMT显著抑制破骨分化标致基因的表达。OMT对于BMSC成骨分化无明显影响。3.Western blot、免疫荧光和核质分离结果均显示OMT可以显著抑制软骨细胞和破骨前体细胞中的NF-κB和MAPK信号通路的激活。4.动物实验中,软骨番红-固绿染色结果显示OMT腹腔注射可以显著延缓小鼠关节软骨磨损。TUNLE染色结果显示,OMT可以显著减少软骨层细胞凋亡。免疫组化结果显示OMT可以显著抑制关节软骨层MMP9和MMP13的表达及NF-κB信号通路的激活。骨显微CT扫描结果显示OMT可以显著减轻OA小鼠膝关节软骨下骨的丢失,TRAP染色显示OMT腹腔注射显著抑制了ACLT小鼠软骨下板(SCP)和软骨下小梁骨(STB)中显示了增多的TRAP阳性多核破骨细胞。结论1.氧化苦参碱可以抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎性退变,同时在体条件下抑制OA软骨退变。2.氧化苦参碱抑制破骨分化的同时对成骨分化没有明显影响,在体条件下可以有效延缓OA软骨下骨的丢失。3.氧化苦参碱可能是通过调节NF-κB和MAPK信号通路,进而行使抑制软骨退变和破骨分化的作用。
【图文】：

氧化苦参碱,炎症反应,和分解,软骨细胞

图 2. 氧化苦参碱抑制 LPS 所诱导的软骨细胞炎症反应和分解代谢。（A）定量 PCR 检测炎症因子和机制金属蛋白酶的表达变化。（B）ELISA 检测炎症因子和机制金属蛋白酶的表达变化。(*) P < 0.05 。Fig.2 Treatment with OMT protects chondrocytes from LPS-induced inflammation andcatabolism. (A) Pro-inflammatory cytokines, including IL-6, -8, -10 and TNF-α, were assessed byreal-time PCR. (B) The expression levels of MMP2, MMP9, MMP13, IL-6 and TNF-α wereinvestigated using ELISA. Data are shown as the means ±S.D of triplicate independent experiments.(*) P < 0.05 compared to the control group.1.4.3 氧化苦参碱延缓离体培养软骨的退变按照实验设计对离体培养的软骨组织块施以不同的处理，对照组不做任何处理，退变组加入 10 μg/ml 的 LPS 促进软骨退变，处理组加入 1 mg/ml 的氧化苦参碱联合 10 μg/ml 的 LPS，对切片行 H&E、Safranin O 染色检测，同时免疫组化检测软骨组织特异性标志物 Collagen II 的表达水平（图 3.A）。在此基础上，对软骨Safranin O 和 Collagen II 的表达强度进行了统计（图 3. B），结果证实组件具有显著差异（P<0.05），说明氧化苦参碱可以显著延缓离体软骨组织的退变。

软骨组织,氧化苦参碱,退变,离体

图 3. 氧化苦参碱延缓 LPS 所诱导的离体软骨组织退变。（A）a-f：软骨组织 H&E 染色；g-l：软骨组织 Safranin O 染色；m-r：软骨组织 Collagen II 免疫组化染色（B）软骨组织 SafraninO 染色强度统计，（C）软骨组织 Collagen II 表达水平统计。(*) P < 0.05 。Fig. 3. OMT attenuates human articular cartilage degradation in an ex vivo model. (A) Humancartilage explants were stained with H&E (a-f) and Safranin O (g-l) Immunohistochemical stainingfor collagen II (m-r). Scale bar, 100 μm. (B) The overall Safranin O staining intensity of theexplants was assessed. (C) The panels show the quantification of collagen II immunohistochemicalstaining.1.4.4 氧化苦参碱抑制软骨组织蛋白聚糖的释放软骨糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又称为粘多糖，是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖，由重复的二糖单位，包括六碳糖或己糖醛酸，链接到己糖胺上而成。糖胺多糖与核心蛋白共价相联，构成蛋白多糖，，成为细胞膜和细胞外基质的主要成分。在软骨退变时，组织释放 GAG，故检测上清液中的 GAG 的含量可以间接反应出软骨退变水平。本部分实验结果表明，在第 7 天与第 14 天培养模型中，氧化苦参碱均可以显著抑制软骨组织块中的 GAG 的释放（图 4）。证实氧化苦参碱可以显著抑制软骨
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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