内生真菌链格孢属F1产胞外多糖培养基和培养条件的优化及多糖特性的研究

发布时间：2020-03-26 11:01

【摘要】：当归(Angelica sinensis),一种多年生草本植物,在中国分布广泛,是中国传统的名贵中药材,国内外研究已表明当归具有活血补血、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性,其临床应用价值极高。植物中的内生真菌分布广、种类多,许多药用植物内生真菌的次生代谢产物具有很高的生物活性,胞外多糖是由微生物细胞产生并分泌到培养基中的一种多糖,研究当归内生真菌胞外多糖的基本特性将对当归在医药业的应用提供一定的依据。本文从当归中分离得到内生真菌,采用正交实验法优化了当归内生真菌产胞外多糖的培养基组分,用响应面法优化了当归内生真菌产胞外多糖的发酵条件,对当归内生真菌产胞外多糖进行了分离纯化,并研究了其抗氧化活性。主要研究结果如下:1.从当归的根中分离得到了内生真菌F1,从菌落形态、显微特征和系统发育树结构等方面分析,最终鉴定其为链格孢属内生真菌(Alternaria.tenuissima)。2.采用单因素试验结合正交试验的方法,以胞外多糖产量为指标,优化了当归链格孢属F1内生真菌产胞外多糖的培养基组分。结果显示,各因素对当归链格孢属F1内生真菌产胞外多糖含量的影响程度依次为:甘露糖酵母提取物镁离子VC。优化得到了当归内生真菌超胞外多糖的最佳培养基配方:甘露糖8%、酵母提取物2%、镁离子0.04%、VC 0.005%。在优化的培养基配方下,胞外多糖平均含量为2.5657mg/mL,接近于预测值,表明优化得到的最佳培养基配方有效可行。3.采用单因素试验结合响应面试验的方法,以胞外多糖产量为响应值,优化了当归内生真菌链格孢属F1产胞外多糖的发酵条件。结果表明,各因素对当归内生真菌链格孢属F1产胞外多糖含量的影响程度依次为:发酵温度pH接种量发酵时间。优化得到的当归内生真菌产胞外多糖的最佳发酵条件为:发酵温度30℃,发酵时间5天,初始pH=7,接种量3%。在此优化条件下,胞外多糖产量为3.32mg/mL,该值与预测值接近,表明该优化发酵工艺合理、可行。4.对当归内生真菌链格孢属F1产胞外多糖进行了分离纯化,并测定了其胞外多糖的基本特性。用DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析法对胞外多糖进行纯化,纯化后的胞外多糖为非还原糖,呈黄色粉末,室温下能溶于水,不溶于乙醇,不含淀粉。用高效液相色谱联用多角度激光散射(HPSEC-MALLS)测得胞外多糖的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)分别为为3.246×104 g/mol和2.012×104 g/mol。使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测得纯化后的胞外多糖主要由5种不同的单糖组成,分别为D-半乳糖醛酸、鼠李糖、D-甘露糖、葡萄糖和D-半乳糖。红外光谱(FT-IR)扫描结果显示该胞外多糖是一种具有吡喃糖分析结构的糖蛋白。扫描电镜(SEM)结果显示,该胞外多糖表面粗糙,呈现多孔网络结构。热重分析和差式扫描量热分析(TGA/DSC)结果显示,该胞外多糖热稳定性好,AH=51.92 J/g。5.抗氧化活性测定结果显示,当归内生真菌链格孢属F1产胞外多糖具有很强的羟自由基清除活性、超氧阴离子清除活性和还原力,抗氧化活性较强。
【图文】：

２．３．２当归内生真菌的分子生物学鉴定结果逡逑从当归的根中分离得到了标记为Ｆ１的内生真菌，通过观察菌落、菌丝和分逡逑生孢子基本特征可以识别其形态类型。内生真菌Ｆ１的菌落特征见图２－１Ａ。菌株逡逑Ｆ１的早期菌落呈白色、粘稠状，然后其菌落逐渐聚集到中心，颜色变深，呈橄榄逡逑绿、近圆形、褶皱状，边缘整齐。内生真菌Ｆ１的微观显微特征描述见２－１Ｂ。菌逡逑株Ｆ１具有酵母样细胞和菌丝形态，分生孢子大量产生，且顶端有很短的次生分逡逑生孢子团。结合以上结论，Ｆ１菌株的所有表形即微观特征都与链格孢属（．逡逑的十分相似，故初步鉴定其为链格孢属内生真菌。逡逑分子生物学鉴定结果见图１Ｃ。通过基于测序结果将Ｆ１的ＩＴＳ序列在ＮＣＢＩ数逡逑据库中进行ＢＬＡＳＴ比对后，收集同源性比较高的比对序列，通过邻接法构建系逡逑统发育树，结果表明Ｆ１与链格孢属（Ａ／ｔｅｒｗａｒｆａ．逦的亲缘关系最近（同逡逑１０逡逑

碳源逦破源浓度逡逑图３．２碳源对胞外多糖产量的影响（Ａ，碳源；Ｂ；甘露糖浓度）逡逑Ｐｉｇ．邋３．２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃａｒｂｏｎ邋ｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｎ邋ＥＰＳ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑菌株生长过程中，碳源是为菌株提高碳素来源的物质，同时，碳也是构成细逡逑胞成分的主要物质［５６］。一般来说，，糖类是菌株生长良好的碳源和能源物质，但不逡逑＇同菌株对不同糖类物质的的吸收利用也是千差万别。逡逑不同碳源对胞外多糖产量的影响见图３．２Ａ。可以看出，ＩＩ归链格孢属Ｆ１内逡逑生真菌可利用多种碳源发酵产生胞外多糖，各糖类物质作为为碳源时，按多糖含逡逑量从氋到低的排列顺序为：甘露糖、木糖、葡萄糖和半乳糖。结果表明，甘露糖逡逑作为碳源时，有利于当归链格孢属Ｆ１内生真菌的利用和多糖积累。故确定最佳逡逑碳源为甘露糖。逡逑１６逡逑
【学位授予单位】：兰州理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6;R284

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本文编号：2601351