黄芪多糖延缓血管内皮细胞衰老的作用及其机制探讨

发布时间：2020-04-02 14:42

【摘要】：研究背景:血管内皮细胞衰老是血管衰老、心血管疾病主要的危险因素之一。在中国传统医学中,中药材黄芪被用于治疗心血管疾病已有2000多年的历史。黄芪多糖是黄芪的主要提取物之一,最近的药理学研究显示,它具备多种生物学功能并具有一定的血管保护作用。方法:从大鼠主动脉提取并体外培养原代内皮细胞以备实验研究,使用CD31及vWF免疫荧光、流式细胞术、低密度脂蛋白摄取、管形成、CCK8、Hoechst染色等技术鉴定内皮细胞并评价内皮细胞的功能活性。利用高糖诱导建立内皮细胞衰老模型,观察黄芪多糖对血管内皮细胞P16、P21等衰老指标、线粒体钠钙交换蛋白(NCLX)表达的影响,siRNA抑制NCLX表达后再次观察黄芪多糖对内皮细胞表达P16等衰老指标、IL-1等炎症指标的影响。siRNA抑制NCLX表达前后分别观察黄芪多糖对内皮细胞LC3B等自噬指标的影响,电镜观察自噬体。结果:1)大鼠主动脉内皮细胞提取和原代培养成功,纯度高达94.65%。体外传至第10代仍有稳定的成管、增殖等功能,且未见传代后的内皮细胞中存在衰老相关的β-半乳糖苷酶染色显著阳性的细胞。2)黄芪多糖可以抑制高糖所诱导的主动脉内皮细胞中衰老相关蛋白P16、P21、P53的表达。3)黄芪多糖增强衰老内皮细胞中NCLX的表达。4)下调NCLX可抑制黄芪多糖的抗衰老作用并增加NLRP3、IL-1炎症因子的表达。5)黄芪多糖可促进细胞LC3BⅠ向LC3BⅡ转化,自噬相关蛋白Atg7聚集增多,使p62/SQSTM 1减少,形成自噬体。结论:本研究开发了一种从大鼠主动脉中分离和培养高纯度的、具有良好功能的血管内皮细胞的新方法,无需胶原酶消化,且体外培养至第10代细胞仍具有功能。黄芪多糖具有延缓血管内皮细胞衰老、抑制炎症的作用,且该作用可能依赖于NCLX的调节。黄芪多糖可通过LC3-p62-Atg7促进自噬体形成,保证自噬通量,这可能是其延缓血管内皮细胞衰老的机制之一。
【图文】：

内皮细胞,抗体标记,纯度,蓝色

将胸主动脉从大鼠体中分离，体外培养血管内皮细胞。从形态学上看，在基质胶逡逑包被的细胞培养板上主动脉组织段迁移出梭形细胞，培养５０－７２小时后内皮细胞沿条逡逑索状排列形成管状（图１－１Ａ）。主动脉组织段在无基质胶包被的细胞培养板上培养时，逡逑观察到在５０－７２小时后有细胞从主动脉周围爬出，，呈短梭形或者类三角形，约９６小逡逑时后，它们沿着胸主动脉段呈单层铺路石状排列（图１－１Ｂ）。培养７－１０天后，细胞覆逡逑盖了约三分之二的细胞培养皿，但在培养皿上分布不均。逡逑W悘逡逑图ｌ－ｉ，大鼠主动脉内皮细胞逡逑图Ａ，用基质胶包被的细胞培养板体外培养的内皮细胞，第５０－７２小时，分布呈条索状。图Ｂ，逡逑无基质胶包被的六孔板培养的内皮细胞，约第９６小时，从大鼠主动脉段迁移出来的内皮细胞呈逡逑单层铺路石状排列。逡逑二、逦大鼠主动脉内皮细胞的纯度逡逑免疫荧光检测第三代内皮细胞表达的ＰＥＣＡＭ－１邋（ＣＤ３１，图１－２Ａ）和ｖｏｎ逡逑Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ

细胞核,碎块,凋亡细胞,红色荧光

通过ＣＣＫ８、管形成试验和Ｐ－半乳糖苷酶染色等评价原代大鼠主动脉内皮细胞在逡逑体外的活性和功能，以及传代培养的影响。Ｐ３、Ｐ１０内皮细胞使用Ｈｏｅｃｈｓｔ邋３３２５８染逡逑色（图１－３Ａ），均未见到明显的凋亡细胞（细胞核呈碎块状、致密浓染、发白）。用ＣＣＫ－８逡逑法分别在第３和第１０代内皮细胞培养的１－５天检测细胞增殖情况，结果可见，第３逡逑和第１０代内皮细胞数量增长趋势大致相同，总体生长速度相似，无显著差异（图逡逑１－４Ｂ）。并且，原代培养的第３代、第１０代内皮细胞在基质胶上培养６小时，均可见逡逑管状结构的形成，验证了此内皮细胞在一定的体外培养条件下仍具有成管的能力（图逡逑１５逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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