OLC1基因在吸烟致癌过程中相关作用机制的研究

发布时间：2018-02-01 07:23

  本文关键词： OLC1基因 肺癌 吸烟 基因工程小鼠 mRNA表达谱　出处：《北京协和医学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肺癌是世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一,具有高发病率和死亡率的特点。香烟烟雾是约90%肺癌病例的主要危险因素。本实验室的前期研究利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization)技术,构建了肺癌差异表达基因文库。OLC1 (Overexpressed in lung cancer 1)是从文库中筛选、发现、克隆并命名的一个基因。进一步研究显示OLC1具有原癌基因属性；而且在肺鳞癌发生的早期(不典型增生和原位癌)阶段,其表达量就已经显著升高。此外,在肺癌组织中OLC1表达水平在吸烟者中显著高于非吸烟者。在人肺癌细胞和人永生化支气管上皮细胞中,香烟烟雾凝集物(cigarette smoke condensate, CSC)能够刺激OLC1表达上调。这些发现提示,OLCl异常表达与癌变、吸烟密切相关。本课题承接研究组前期工作,针对OLCl基因在吸烟致癌过程中的作用进行研究。首先在较大样本非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中检测OLC1蛋白的表达情况,并分析其临床意义。随后,利用基因表达谱芯片技术,以非小细胞肺癌细胞系和基因工程小鼠为研究对象,分别在体外和体内实验中模拟吸烟因素和OLC1基因异常表达在吸烟致癌过程中的作用,以获得在相关改变过程中的基因表达变化谱型。通过生物信息学分析,筛选差异表达基因并进行相应验证,初步探讨其在吸烟致癌过程中的生物学意义,为揭示OLC1在吸烟致癌过程中的分子机制奠定基础。首先,对172例NSCLC患者手术切除组织进行OLCl蛋白免疫组织化学染色以检测OLC1在肿瘤组织中的表达情况,并结合临床信息分析OLC1蛋白水平与性别、吸烟、疾病分期、分化程度等因素之间的关系。结果显示,OLC1蛋白在癌组织中的水平显著高于癌旁正常组织,并与肺鳞癌中的吸烟因素显著相关。体外实验主要以人肺癌细胞系A549和H1299为研究对象。Western blot分析结果显示,以4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)、3-甲基胆葸(MCA)和苯并芘(B[a]P)等香烟中典型致癌物分别处理细胞,都不影响OLC1蛋白的表达水平。以香烟烟雾凝集物(CSC)处理后,肺癌细胞中代谢反应、氧化应激反应和生物解毒等防御机制相关基因mRNA表达水平升高。在A549细胞中,CSC刺激上调了肺泡间隔发育和上皮细胞分化相关基因；在H1299细胞中,CSC刺激下调了细胞周期功能相关的基因。稳定过表达OLC1的肺癌细胞系(A549/OLC1, H1299/OLC1) GO富集显示,OLC1基因改变影响众多生物学过程,如形态发生、细胞黏附、神经元投射引导、循环系统过程、细胞呼吸、转运活性调节等等。而以CSC刺激稳定过表达OLC1的A549细胞,GO富集结果提示,CSC处理促进细胞黏附相关mRNA表达上调,进一步抑制了细胞转运活性。利用GEO数据库中免疫、炎症相关基因集,在A549细胞mRNA表达谱中筛选免疫、炎症相关差异表达基因,再与本实验室以往构建的肺鳞癌多阶段发生模型mRNA表达谱联合分析,最终得到8个在A549/OLC1细胞中特异差异表达的“免疫／炎症／癌变相关”基因。采用OLC1全身非特异过表达小鼠(C57BL/6J/OLC1)和全身非特异性敲降小鼠(C57BL/6J/OLC1si)进行香烟烟雾暴露实验。分别在香烟暴露3个月(短期)和7个月(长期)后处死小鼠获取肺组织,进行mRNA表达谱分析。结果显示,OLC1基因在小鼠神经系统以及器官发育相关生物学过程中有重要作用。此外,C57BL/6J/OLC1小鼠中差异表达基因的GO富集结果还显示OLC1过表达与感官知觉和外界刺激有较大联系,而在C57BL/6J/OLC1si小鼠中,差异表达基因的GO富集体现其与免疫系统相关。短期香烟暴露刺激都引起小鼠的免疫反应相关mRNA改变。相较于野生型(WT)小鼠,C57BL/6J/OLC1小鼠对于机体缺氧反应表现更为敏感。而来源于C57BL/6J/OLC1si小鼠的数据提示,吸烟、OLC1基因以及嗅觉传导信号通路三者之间存在联系。香烟暴露后,OLC1基因工程小鼠KEGG显著富集的通路都与黏附功能相关,提示OLC1可能参与细胞迁移。长期香烟暴露后,WT小鼠表达上调的基因仍然主要富集于机体对香烟暴露的防御机制上,如体液免疫、炎症反应和外界刺激反应等；表达下调的基因主要与器官发育有关。相反,C57BL/6J/OLC1小鼠肺组织中表达上调的基因与器官发育相关,如呼吸系统发育等。发育相关基因mRNA水平重新上调,是癌症发生的重要信号之一。表达下调的基因则与蛋白多糖生物合成、蛋白激酶B信号通路以及细胞周期负调控等相关,显示机体对香烟暴露刺激的防御机制受到了抑制。而这些现象都未在C57BL/6J/OLC1si小鼠中出现。与人肺癌细胞系表达谱分析方法类似,同样在小鼠肺组织mRNA表达谱中筛选得到43个“免疫／炎症／癌变相关”基因。经过KEGG通路显著富集,最终得到13个用于候选研究的基因。综上所述,本项研究显示OLC1基因在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中异常高表达；CSC处理上调A549细胞中肺泡间隔发育和上皮细胞分化相关基因,下调H1299细胞中细胞周期功能相关的基因；CSC刺激A549/OLC1细胞后促进细胞黏附相关基因mRNA上调,进一步抑制了细胞转运活性；筛选获得8个在A549/OLC1细胞中特异差异表达的“免疫／炎症／癌变相关”基因；OLC1基因工程小鼠mRNA表达谱结果揭示OLC1基因在小鼠神经系统以及器官发育中有重要作用。短期香烟烟雾暴露后,OLC1基因工程小鼠差异基因即显著富集于黏附相关通路；长期香烟暴露后,C57BL/6J/OLC1小鼠肺组织中器官发育相关基因上调,机体针对香烟烟雾暴露的防御机制受到抑制；在香烟烟雾暴露的OLCl基因工程小鼠肺组织mRNA表达谱中筛选获得13个“免疫／炎症／癌变相关”候选研究基因。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
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本文编号：1481292