功能纳米荧光探针用于肿瘤细胞成像及诊治研究

发布时间：2016-12-12 15:54

  本文关键词：功能纳米荧光探针用于肿瘤细胞成像及诊治研究，由笔耕文化传播整理发布。

《山东师范大学》 2014年

功能纳米荧光探针用于肿瘤细胞成像及诊治研究

潘伟  

【摘要】：癌症是严重威胁人类生命和社会发展的重大疾病，是致人死亡的主要原因之一，其发病率呈逐年上升的趋势，因此，癌症的预防和治疗是目前人类医学健康面临的最大挑战。一方面，癌症的早期发现和诊断是预防和治疗癌症的关键，研究表明若能早期发现和做出正确诊断，并采取相应的治疗措施，可极大提高治愈率和生存率。然而，目前的常规诊断方法特异性和灵敏度较低，在肿瘤发生早期较难检测，当确诊时肿瘤细胞已经发生浸润和转移，从而错过治疗的最佳时机。为了尽早发现和诊断癌症，研究者致力于在细胞水平上利用肿瘤标志物的表达来检测和识别肿瘤细胞。另一方面，为了提高癌症的治疗效果，大量研究集中在开发新的药物和治疗方法，但目前化疗还存在许多缺陷，例如化疗药物的毒副作用大、靶向治疗效果差、肿瘤细胞会产生耐药性等，因此迫切需要我们发展可控释放的药物载体并靶向输送药物到肿瘤细胞，降低药物的剂量和毒副作用，增强药物的治疗效果，进而提高化疗的治疗效果。 近年来，随着纳米科技的不断发展，，纳米荧光探针已经被广泛应用于化学、生物学、医学等领域，尤其是肿瘤细胞的诊断、成像及治疗。在这些纳米材料中，金纳米粒子有着独特的光学特性和生物亲和性，因此在生物检测、细胞和活体成像、药物输送等方面吸引了人们的广泛关注。尤其是高灵敏度、高选择性对多种肿瘤标志物的检测和成像，是目前研究的热点和难点，而将多组分检测的策略应用于生物模型中，实现动态实时对活细胞内多种物质的同时测定是目前研究的一个巨大挑战。研究表明目前还没有能够同时检测四种或四种以上肿瘤标志物的纳米探针被成功应用在活细胞中进行生物成像，而且大部分多色纳米探针都是检测同一类型的肿瘤标志物，为了更好地避免假阳性结果的出现，发展能同时检测细胞内多种肿瘤标志物及不同类型的肿瘤标志物的探针并用来进行早期癌症的诊断是非常必要且有意义的。另外，当前的药物载体主要集中在单一靶向的药物释放，无法同时实现对肿瘤细胞特异性识别和药物的可控输送，发展多重靶向的药物载体对于特异性识别肿瘤细胞、肿瘤细胞内的可控释放、减少用药量、提高治疗效果有着重要的理论意义和实际价值。 本论文基于细胞内的mRNA、基质金属蛋白酶(MMP)以及细胞表面的受体，利用金纳米粒子、DNA和肽链，设计制备了一系列纳米探针并用于肿瘤细胞的检测、成像、靶向输送及治疗，具体包括： 1.基于金纳米粒子和DNA分子信标设计了一种四色纳米荧光探针，纳米探针组装以后，荧光团的荧光被金纳米粒子猝灭，当遇到目标mRNA后，荧光恢复。首次实现了细胞内四种肿瘤mRNA的同时检测和成像。这个探针具有响应快速、特异性好、抗酶切特性以及好的生物亲和性等优点。该探针可以有效区分乳腺癌细胞、肝癌细胞及正常乳腺细胞和肝细胞，并能评估肿瘤mRNA在细胞中的不同表达水平。相比较传统的单一或者双组分mRNA的检测，该方法可以更有效地避免假阳性结果，从而提高癌症早期诊断的准确性，为癌症诊断提供更加全面可靠的信息。 2.利用分步组装的方式，将DNA分子信标和肽链组装到金纳米粒子表面，制备了一种四色纳米荧光探针。DNA分子信标和肽链上的荧光团可以被金纳米粒子猝灭，当遇到目标mRNA，分子信标会打开，荧光得以恢复；在MMP存在时，肽链会被切断并释放出荧光，从而实现对细胞内mRNA和MMP两种不同类型的肿瘤标志物的同时检测和成像。该探针首次实现了活细胞内不同类型的多种肿瘤标志物的检测和成像，并能够区分正常细胞和肿瘤细胞以及判断不同标志物表达水平的变化，既可以防止假阳性结果的出现，同时也可以提高肿瘤细胞早期诊断的准确性。 3.基于荧光共振能量转移的原理，发展了一种单一波长激发同时检测两种肿瘤标志物的方法。在两个识别不同mRNA的分子信标上，连接可以发生荧光共振能量转移的两个荧光染料(Alexa Fluor488和Cy3)，然后将两个分子信标组装到金纳米粒子表面，设计了一种纳米荧光探针（488nm激发收集Cy3的荧光）。在一种mRNA存在时，不会产生荧光信号，只有当细胞内两种mRNA都过表达时，才能收集到荧光信号，该方法可以在单一波长激发下同时检测细胞内的两种mRNA，有效减少多次激发造成的细胞损伤和背景干扰，还可避免单一检测可能造成的假阳性结果。 4.基于细胞表面的受体和细胞内的mRNA，发展了一种双重靶向的纳米载体。在金纳米粒子表面组装上修饰叶酸的DNA和靶向细胞内mRNA的分子信标，叶酸可以与肿瘤细胞表面的叶酸受体相结合增强细胞对纳米载体的摄取，分子信标茎部的GC序列携带阿霉素分子，当遇到肿瘤细胞中过表达的mRNA时，释放出药物分子，达到双重靶向的目的。实验结果表明纳米载体具有良好的稳定性、抗酶切性质以及生物亲和性，可以有效保护正常细胞并杀死肿瘤细胞，降低药物的用量并能显著增强药物的治疗效果。

【关键词】：
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R730.4;O657.3
【目录】：

目录4-8

摘要8-11

Abstract11-14

第一章 绪论14-50

1.1 癌症及其诊断与治疗14-21

1.1.1 癌症概述14-15

1.1.2 癌症的诊断15-17

1.1.3 癌症的治疗17-20

1.1.4 肿瘤标志物在癌症诊断与治疗中的意义20-21

1.2 金纳米粒子及其在肿瘤细胞检测与治疗中的研究21-36

1.2.1 金纳米粒子概述21-28

1.2.2 金纳米粒子用于肿瘤细胞检测28-33

1.2.3 金纳米粒子用于肿瘤细胞治疗33-36

1.3 本论文的选题背景和研究意义36-37

参考文献37-50

第二章 基于金纳米粒子-分子信标的四色纳米荧光探针用于肿瘤细胞内 mRNA 的检测与成像50-70

摘要50

2.1 引言50-52

2.2 实验部分52-57

2.2.1 试剂与仪器52

2.2.2 DNA 的合成52

2.2.3 金纳米粒子(AuNPs)的制备52-53

2.2.4 MB 的结构53

2.2.5 纳米探针的制备53-54

2.2.6 纳米探针上 MB 数量的确定54-55

2.2.7 特异性实验55

2.2.8 动力学研究55

2.2.9 杂交实验55

2.2.10 核酸酶稳定性实验55-56

2.2.11 细胞培养56

2.2.12 MTT 实验56

2.2.13 荧光共聚焦成像56-57

2.2.14 实时荧光定量 RT-PCR57

2.3 结果与讨论57-66

2.3.1 纳米探针的制备与表征57-58

2.3.2 纳米探针的化学体系研究58-59

2.3.3 核酸酶稳定性研究59-61

2.3.4 MTT 实验61

2.3.5 纳米探针的细胞内成像61-64

2.3.6 细胞内 mRNA 表达水平的评估64-66

2.4 结论66

参考文献66-70

第三章 基于金纳米粒子-分子信标-肽链的四色纳米荧光探针用于肿瘤细胞内多种 mRNA 和MMP 的同时检测与成像70-90

摘要70

3.1 引言70-72

3.2 实验部分72-79

3.2.1 试剂与仪器72-73

3.2.2 肽链的合成73

3.2.3 DNA 的合成73-74

3.2.4 MB 的结构74

3.2.5 金纳米粒子的制备74

3.2.6 多色复合纳米探针的分步组装与制备74-76

3.2.7 纳米探针上组装的 DNA 及肽链数量的确定76

3.2.8 纳米探针的特异性实验76

3.2.9 动力学研究76-77

3.2.10 纳米探针对 DNA 靶分子的响应77

3.2.11 纳米探针对 MMP-2 和 MMP-7 的响应77

3.2.12 细胞培养77-78

3.2.13 荧光共聚焦成像78

3.2.14 MTT 实验78-79

3.3 结果与讨论79-87

3.3.1 复合纳米探针的制备与表征79-80

3.3.2 复合纳米探针对靶的响应80-82

3.3.3 MTT 实验82-83

3.3.4 纳米探针的细胞内成像83-87

3.4 结论87

参考文献87-90

第四章 基于荧光共振能量转移的纳米探针用于细胞内多种 mRNA 的同时检测与成像90-110

摘要90

4.1 引言90-92

4.2 实验部分92-98

4.2.1 试剂与仪器92-93

4.2.2 DNA 的合成93

4.2.3 金纳米粒子的制备93

4.2.4 MB 的结构93

4.2.5 单色纳米探针的制备93-94

4.2.6 FRET 纳米探针的制备94-95

4.2.7 纳米探针组装的 DNA 数量的确定95

4.2.8 细胞培养95

4.2.9 特异性实验95-96

4.2.10 动力学研究96

4.2.11 杂交实验96

4.2.12 核酸酶稳定性实验96

4.2.13 MTT 实验96-97

4.2.14 荧光共聚焦成像97

4.2.15 流式细胞术97

4.2.16 实时荧光定量 RT-PCR97-98

4.3 结果与讨论98-106

4.3.1 纳米探针的制备与表征98-99

4.3.2 纳米探针的化学体系研究99-101

4.3.3 核酸酶稳定性研究101-102

4.3.4 MTT 实验102

4.3.5 纳米探针的细胞内成像102-106

4.4 结论106

参考文献106-110

第五章 基于细胞表面受体和细胞内 mRNA 的双重靶向的纳米药物载体用于肿瘤细胞成像和治疗110-140

摘要110

5.1 引言110-112

5.2 实验部分112-118

5.2.1 试剂与仪器112

5.2.2 DNA 的合成112-113

5.2.3 金纳米粒子的制备113

5.2.4 MB 的结构113-114

5.2.5 MB 和 Dox 结合作用研究114

5.2.6 纳米载体的制备114

5.2.7 纳米载体上 MB 和 FA-DNA 的负载量的确定114-115

5.2.8 特异性实验115

5.2.9 纳米载体中 Dox 的释放研究115

5.2.10 纳米载体的稳定性研究115

5.2.11 核酸酶稳定性研究115-116

5.2.12 细胞培养116

5.2.13 不同细胞对纳米药物载体的摄取量研究116

5.2.14 荧光共聚焦成像116-117

5.2.15 流式细胞术117

5.2.16 实时荧光定量 RT-PCR117

5.2.17 MTT 实验117-118

5.3 结果与讨论118-134

5.3.1 两种不同功能的 DNA 的设计及 MB 与 Dox 的相互作用118-119

5.3.2 纳米药物载体的优化119-120

5.3.3 纳米药物载体的表征120

5.3.4 纳米药物载体对 DNA 靶的响应及特异性120-122

5.3.5 纳米载体的稳定性122-124

5.3.6 不同类型的细胞对纳米药物载体的摄取量研究124-125

5.3.7 细胞内释放研究125-128

5.3.8 纳米药物载体调控的细胞凋亡研究128-131

5.3.9 纳米药物载体根据细胞内 mRNA 表达量不同的释放能力研究131-134

5.4 结论134

参考文献134-140

攻读博士学位期间发表的学术论文及参与的课题140-142

致谢142

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4 林佳奇;金纳米粒子聚集行为以及与细胞膜相互作用的模拟研究[D];大连理工大学;2012年

5 付娆;金属离子修饰的金纳米粒子对生物分子的吸附行为研究[D];吉林大学;2013年

6 郭轶;利用赖氨酸和赖氨酸肽修饰和组装金纳米粒子[D];吉林大学;2007年

7 王纯荣;软物质团簇制备金纳米粒子的可调控软模板作用研究[D];江南大学;2007年

8 何化;基于纳米粒子探针的光学成像新方法研究[D];上海交通大学;2008年

9 王志江;金纳米粒子及其复合材料的可控合成与结构和性能研究[D];哈尔滨工业大学;2010年

10 张志强;金纳米粒子自组装纳米结构的研究[D];中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 刘克增;金纳米粒子与生物大分子相互作用的研究及其在催化中的应用[D];烟台大学;2009年

2 张玲;金纳米粒子的制备及其磁性能表征[D];华中科技大学;2009年

3 赵艳梅;单层配体保护的金纳米粒子合成及识别作用研究[D];山西大学;2010年

4 胡云丽;基于金纳米粒子团聚及荧光共振能量转移的三聚氰胺检测[D];天津大学;2010年

5 梁士金;表面修饰的金纳米粒子及其自组织而成的结晶体的制作及其表征[D];暨南大学;2002年

6 蒋凌风;液相荧光金纳米粒子的制备、表征及其在分析中的应用[D];广西师范大学;2005年

7 宋香宁;柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子的研究[D];吉林大学;2007年

8 王健;金纳米粒子的形态及分析应用研究[D];西南大学;2008年

9 屈彩婷;基于金纳米粒子的化学传感器研究与应用[D];湖南科技大学;2011年

10 崔晓锦;金纳米粒子自组装行为的研究[D];上海交通大学;2011年

  本文关键词：功能纳米荧光探针用于肿瘤细胞成像及诊治研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：210791