靶向端粒G-四链体DNA的抗肿瘤铂化合物的合成、表征及其作用机理研究

发布时间：2017-03-22 00:10

  本文关键词：靶向端粒G-四链体DNA的抗肿瘤铂化合物的合成、表征及其作用机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：DNA是一个经典的抗肿瘤药物靶点。然而,在细胞核内中存在着大量的双螺旋DNA,以双螺旋DNA为靶点的抗肿瘤药物会非特异性的结合到DNA上,产生严重的毒副作用。为了降低抗肿瘤药物的毒副作用,设计合成毒性低、选择性更好的抗肿瘤药物是当今药物学家面临的巨大挑战。除了双螺旋结构外,核酸的一些二级结构,如富G序列形成的G-四链体DNA也成为重要的抗肿瘤药物靶点。与双螺旋结构相比,G—四链体DNA在尺寸、loop和结构上有很大的不同,而G-四链体结构的这种多样性,则使设计合成能够选择性识别G-四链体DNA的小分子配体成为可能。 本文主要目标是合成以G-四链体DNA为靶点的活性好、毒性低的抗肿瘤配合物。为此,设计合成了一系列取代基不一样的多吡啶铂配合物21个,并对其进行了结构表征。用谱学方法研究了这些配合物对ct-DNA和G-四链体DNA的选择性,并且通过体外生物实验检测了这些配合物对端粒酶活性的抑制作用和对肿瘤细胞增殖的影响,以及它们对端粒酶逆转录酶hTERTmRNA表达的影响。初步探讨了其抗肿瘤作用机理。 本文分为四章： 第一章,为前言,简述了G—四链体DNA的结构特征及其生物学功能；端粒DNA的结构和功能；以G—四链体为靶点的抗肿瘤小分子配体的研究进展。 第二章,本论文合成了21个1,10—菲罗啉苯并咪唑衍生物的铂(Ⅱ)配合物,并用ESI-MS、元素分析、IR、1HNMR和UV-Vis等对其结构进行了表征。 第三章,MTT实验结果表明,大部分配合物对肿瘤细胞株(MGC80-3、 BEL-7404、SPC-A-2和HeLa)的生长均表现出很强的抑制作用,绝大部分配合物的IC50在20μmol/L以下,配合物对SPC-A-2活性的抑制作用尤其明显,而且配合物对人正常肝细胞株(HL-7702)毒性较低。总结构效关系发现,取代基对配合物的抗肿瘤活性有比较大的影响,甲氧基取代基配合物有很强的抗肿瘤活性,羟基取代基配合物的活性次之,硝基取代基的活性最差。 流式细胞术结果发现,配合物1-9作用于人宫颈癌细胞HeLa72h后,将宫颈癌细胞HeLa阻滞于sub-G1期,亚二倍体sub-G1的出现,表明配合物1-9能够诱导宫颈癌细胞HeLa凋亡,宫颈癌细胞HeLa的细胞周期sub-G1期DNA含量的增加呈浓度依赖性。配合物1-9诱导宫颈癌细胞HeLa凋亡呈浓度依赖性。 端粒酶活性的抑制作用和hTERT mRNA的表达调控研究发现,筛选的9种配合物对端粒酶都有很强抑制作用,端粒酶活性抑制率在62.16%到85.39%,配合物1-9都能够下调HeLa细胞中hTERT mRNA的表达。 第四章,用紫外、荧光和圆二色等谱学方法研究了21个配合物与不同DNA(ct-DNA和G-quadruplex DNA)的相互作用,结果如下： 1.配合物能够与DNA产生静电相互作用。所有配合物与SDS作用后,随着SDS浓度从[SDS]：[配合物]=0-2.5逐渐增大,配合物的最大紫外吸收都出现了减色效应,减色率在35-59%之间,减色是因为配合物与SDS的磺酸基相互作用引起的。 2.用紫外光谱研究了配合物与ct-DNA和G—四链体DNA的相互作用。配合物与DNA的作用引起配合物吸收峰减色,部分配合物的最大吸收发生红移,这是配合物与ct-DNA之间存在静电作用和经典插入作用共同引起的。而配合物与端粒G—四链体H21T除采取堆积模式结合外,还可能与G—四链体DNA的磷酸骨架和loop作用。配合物与G-四链体H21T作用的结合常数(Kb)约为ct-DNA结合常数的25～95倍,配合物会优先与端粒G—四链体H21T结合。吸电子基团的存在有助于增强配合物与ct-DNA的相互作用,而供电子基团的存在有助于增强配合物与G—四链体的堆积作用。 3.用荧光竞争法(G4-FID)实验研究配合物对四种G—四链体DNA(ckit1、 ckit2、H21T、pu22)和一种双螺旋DNA (ds26)的选择性。配合物与不同G—四链体DNA有很强的结合作用,DC50值在0.2-0.9μmol/L之间,与双螺旋DNA(ds26)作用的DC50值在1.2-2.0μmol/L之间。配合物与G—四链体DNA结合能力强于双螺旋DNA,配合物对端粒G—四链体H21T具有一定的选择性识别作用,但这种选择性不是很明显。FRET熔点实验发现所筛选的8个配合物能提高G—四链体F21T的解链温度Tm,值,说明配合物能有效的稳定端粒G-四链体H21T。 4.用CD光谱研究了不同DNA和配合物作用后DNA的构象变化。当配合物加入到ct-DNA中时,ct-DNA的正负吸收峰都发生了明显的强度改变,部分配合物还发生了蓝移；而配合物能使溶液中无序的单链端粒DNA在290nm处弱吸收峰强度增加,在263nm附近新的负吸收峰强度也增强,诱导单链端粒DNA形成反平行G—四链体结构。配合物加入到混合型端粒G—四链体DNA中,使平行G—四链体结构的特征吸收峰消失,反平行G—四链体结构的特征吸收峰增强。可见配合物能够诱导单链的端粒DNA形成反平行G—四链体结构,并稳定这种结构。结合MTT法、CD、UV-Vis和G4-FID的实验结果可知,配合物对端粒酶活性的抑制有可能是通过诱导端粒单链富G序列形成G-四链体结构并稳定这种结构而起作用的。 本文初步研究了所合成的铂配合物的抗肿瘤作用机理。本文所获得的结果为设计合成新颖的抗肿瘤化合物提供了一种新的策略。
【关键词】：靶向 端粒G-四链体DNA 端粒酶活性 抗肿瘤铂(Ⅱ)配合物 细胞毒性机制
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：O641.4
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 前言13-39
• 1.1 G—四链体DNA结构及其生物功能13-21
• 1.1.1 G—四链体DNA结构特征13-17
• 1.1.2 G—四链体DNA的生物学功能17-21
• 1.2 端粒和端粒G—四链体结构21-27
• 1.2.1 端粒及其功能21-22
• 1.2.2 端粒G—四链体结构22-27
• 1.3 靶向G—四链体DNA的小分子化合物的研究进展27-35
• 1.3.1 靶向G-四链体DNA的有机化合物的研究进展27-30
• 1.3.2 靶向G-四链体DNA金属配合物研究进展30-35
• 1.4 本论文的设计思路35-36
• 1.5 本论文合成配合物的结构式及命名36-39
• 第二章 多吡啶铂(Ⅱ)配合物的合成和表征39-54
• 2.1 引言39
• 2.2 实验原料、试剂及仪器设备39
• 2.3 芳基咪唑[4,5-f][1,10]菲咯啉类铂配合物的设计合成39-41
• 2.3.1 芳基咪唑[4,5-f[1,10]菲咯啉类铂配合物的合成路线39-40
• 2.3.2 芳基咪唑[4,5-f][1,10]菲咯啉中间体的合成40-41
• 2.3.3 芳基咪唑[4,5-f][1,10]菲咯啉铂配合物的合成41
• 2.4 芳基咪唑[4,5-f][1,10]菲咯啉铂配合物的表征41-52
• 2.5 芳基咪唑[4,5-f][1,10]菲咯啉配合物合成讨论52-54
• 2.5.1 邻菲咯啉—5,6—二酮合成52
• 2.5.2 芳基咪唑[4,5-f][1,10]菲咯啉配体的合成52-53
• 2.5.3 芳基咪唑[4,5-f][1,10]菲咯啉二氯化铂中间体的合成53
• 2.5.4 芳基咪唑[4,5-f][1,10]菲咯啉配合物的合成53-54
• 第三章 铂(Ⅱ)配合物抗肿瘤活性及抑制端粒酶活性研究54-76
• 3.1 引言54
• 3.2 实验仪器与试剂54
• 3.3 实验方法54-57
• 3.3.1 细胞的接种与培养54-55
• 3.3.2 配合物细胞水平的活性初筛55
• 3.3.3 配合物抗肿瘤活性机制的初步研究55-57
• 3.4 结果及讨论57-75
• 3.4.1 配合物在体外对肿瘤细胞的抑制率57-59
• 3.4.2 配合物在体外对肿瘤细胞株的IC_(50)值的测定59-65
• 3.4.3 流式细胞术检测配合物1-9对肿瘤细胞HeLa周期的影响65-68
• 3.4.4 流式细胞术研究配合物1-9诱导肿瘤细胞HeLa凋亡的情况68-71
• 3.4.5 配合物1—9对HeLa端粒酶活性抑制作用及hTERT mRNA表达的影响71-75
• 3.4 本章小结75-76
• 第四章 铂(Ⅱ)配合物与G—四链体DNA相互作用研究76-129
• 4.1 引言76
• 4.2 实验试剂与仪器76-77
• 4.2.1 实验试剂76-77
• 4.2.2 实验仪器77
• 4.3 溶液配制77-78
• 4.4 小分子化合物与G—四链体DNA相互作用的研究方法78-80
• 4.4.1 圆二色光谱法(CD)78
• 4.4.2 荧光共振能量转移技术(FRET)78-79
• 4.4.3 荧光竞争技术(G4—FID)79-80
• 4.4.4 紫外可见吸收光谱(UV—Vis)80
• 4.5 甲氧基取代配合物1-13与DNA相互作用结果及讨论80-108
• 4.5.1 紫外光谱研究甲氧基取代配合物1-13稳定性80-83
• 4.5.2 紫外光谱研究甲氧基取代配合物1-13与DNA的静电作用83-86
• 4.5.3 配合物1-13与DNA相互作用的紫外光谱滴定86-93
• 4.5.4 配合物1-13对不同DNA的选择性研究93-97
• 4.5.5 配合物1、5、8、10、12对端粒G—四链体H21T的稳定能力研究97-100
• 4.5.6 配合物1-13与DNA相互作用的圆二色谱(CD)100-108
• 4.6 羟基、硝基和二甲胺基取代的配合物14-21与DNA相互作用结果及讨论108-126
• 4.6.1 紫外光谱研究配合物14-21稳定性108-110
• 4.6.2 紫外光谱法研究配合物14-21与DNA的静电作用110-111
• 4.6.3 配合物14-21与DNA相互作用的紫外光谱滴定111-116
• 4.6.4 配合物14-21对不同DNA的选择性研究116-118
• 4.6.5 配合物14、17和21对端粒G—四链体H21T的稳定能力研究118-121
• 4.6.6 配合物14-21与DNA相互作用的圆二色谱(CD)121-126
• 4.7 其他配合物与G—四链体的相互作用研究126-128
• 4.8 本章小结128-129
• 第五章 总结129-131
• 参考文献131-150
• 附录150-161
• 致谢161-162
• 攻读博士学位期间主要的研究成果162-163

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 卢继新,张贵珠,黄志娜,赵鹏;巯嘌呤金属配合物与小牛胸腺DNA的作用[J];化学学报;2002年06期

2 ;NOTICE TO AUTHORS[J];Cell Research;1999年01期

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本文编号：260538