SOCS3基因对子宫内膜癌细胞增殖和迁移作用的研究

发布时间：2017-06-30 21:07

  本文关键词：SOCS3基因对子宫内膜癌细胞增殖和迁移作用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：世界范围内,子宫内膜癌是仅次于宫颈癌的女性生殖道恶性肿瘤,且其发病率呈上升趋势。目前在西方这一肿瘤已成为女性生殖道肿瘤中最为常见的病种,占新发现妇科肿瘤的一半。一般而言,患者年龄在60至70岁之间,而一般女性一生中罹患子宫内膜癌的风险在2.5%左右。90%子宫内膜癌患者的临床症状表现为绝经后阴道流血,不过绝经后的阴道流血患者中仅有10%最后确诊为子宫内膜癌,部分患者还可出现阴道流液,此类患者早期可仅表现为少量血性白带,随着疾病进展而发生严重感染时可出现脓血样液体排出。绝经前女性的首发症状则往往为月经周期混乱,并有部分患者在宫颈涂片检查中偶然发现异常子宫内膜细胞。根据FIGO(2009)分期,子宫内膜癌可分为4期：Ⅰ期指肿瘤局限于子宫体部,并进一步分为Ia期及Ib期,其中Ia期肿瘤浸润深度小于子宫肌层二分之一,而Ib期肿瘤浸润深度则已超过或等于子宫肌层的二分之一；Ⅱ期指肿瘤已侵犯宫颈间质,但尚无宫体外蔓延；Ⅲ期指肿瘤已有局部和(或)区域扩散,其中Ⅲa期指肿瘤已侵犯子宫浆膜层和(或)附件,Ⅲb期指肿瘤已侵犯阴道和(或)宫旁组织,Ⅲc期指盆腔淋巴结和(或)腹主动脉旁淋巴结转移,Ⅲcl期指盆腔淋巴结阳性,Ⅲc2期指腹主动脉旁淋巴结阳性伴(或不伴)盆腔淋巴结阳性；Ⅳ期指肿瘤侵犯膀胱和(或)直肠粘膜,和(或)远处转移,Ⅳa期指肿瘤侵犯膀胱和(或)直肠粘膜,4b期肿瘤远处转移,包括腹腔内和(或)腹股沟淋巴结转移。80～90%属于内膜样癌,按腺癌分化程度分为Ⅰ级(高分化G1),Ⅱ级(中分化G2),Ⅲ级(低分化G3)三级。对于子宫内膜癌而言,其预后整体而言相对较好,且多数患者在就诊时多处于疾病早期。影响预后的因素主要有：1、肿瘤的恶性程度及病变范围,包括手术病理分期、组织学类型、肿瘤分级、肌层浸润深度、淋巴转移及子宫外转移等；2、患者全身状况；3、治疗方案的选择。多数子宫内膜癌的复发在手术治疗后的2-3年内出现。对于子宫内膜癌的首选治疗方式为手术,手术目的是进行手术病理分期,确定病变范围及手术预后相关因素,切除病变子宫及其他可能存在转移的病灶,首先留取腹腔积液或盆腔冲洗液进行细胞学检查,然后腹腔探查。如考虑存在子宫外部侵犯的患者,还需进行扩大的筋膜外子宫切除术及双侧输卵管卵巢切除。同时,许多患者在术后为避免阴道穹窿的复发及淋巴结转移等原因仍需接受辅助治疗。在手术术式选择中,目前已有充足证据支持使用腹腔镜进行子宫切除术或者是腹腔镜辅助下的经阴道子宫切除术。放疗也是常用的治疗方式,这一治疗既可用于术后的辅助治疗,也可单独作为不适宜接受手术患者的根治性治疗,并且可应用于术后复发患者的局部治疗。目前尽管术后辅助性放疗可以改善局部复发控制情况,但对于患者的整体生存仍无明显改善。与之相比,对于高危患者的早期化疗目前尚无统一定论。目前认为子宫内膜癌有两种发病类型：雌激素依赖型(Ⅰ型)与(Ⅱ型)非雌激素依赖型,子宫内膜癌绝大多数(80%)属于Ⅰ型,该型往往继发于子宫内膜不典型增生。肥胖、不孕、胰岛素抵抗以及长期无孕激素拮抗的应用雌激素治疗等因素均与Ⅰ型子宫内膜癌发病相关。而Ⅱ型子宫内膜癌则包括子宫内膜浆液性癌、透明细胞癌、腺鳞癌、粘液腺癌等类型,与雌激素作用无关,癌灶容易扩散,预后较差。两者在分子机制层面也各具特点。Ⅰ型子宫内膜癌通常具有PTEN抑癌基因、K-ras、Beta-catenin等基因的突变及错配修复基因缺陷有关。而Ⅱ型子宫内膜癌多与p53抑癌基因的突变相关。可见子宫内膜癌发病机制复杂,而具体发病的机理却尚未明确阐明。可见目前子宫内膜癌的治疗仍充满挑战,而对其致病分子机制的研究则可能使我们获得更为有效、特异的治疗方式。这其中针对调节肿瘤细胞增殖及迁移等与预后密切相关的分子信号通路的研究一直是子宫内膜癌研究领域的中心问题。细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族在调节细胞的生长、分化等方面发挥重要作用,该家族在恶性肿瘤疾病中的作用已日益引起人们的关注。SOCS家族是1997年以来相继被发现的JAK/STAT信号通路的主要负性调控因子家族,由SOCS1-SOCS7和CIS共8种成员组成,其结构相似,由N区、中央区SH2结构域和C端SOCS盒组成。目前对SOCS3的研究较为清楚,其广泛表达于不同类型组织和细胞中。SOCS3基因(NM 003955.3)位于17q25.3, CDS区由675个连续的核苷酸组成,编码225个氨基酸,编码框的上游约1.1kb范围内是该基因的启动子区,其在人、大鼠、小鼠之间具有高度保守性,均由两个STAT结合域、一个TAT框和一个GC富集区组成。SOCS-3基因的启动子含有STAT1/STAT3和STAT5b的结合位点。这类因子主要与JAK/STAT信号传导通路相互作用。SOCS-3是SOCS家族中研究最多的成员之一,已有研究提示多种肿瘤组织中SOCS3基因启动子区CpG岛存在高度甲基化,而基因启动子区失活是导致抑癌基因失活的主要机制,SOCS3基因可能作为一个抑癌基因发挥作用。He首次于2003年发现了在人肺癌中SOCS3启动子超甲基化导致其基因沉默,SOCS3蛋白表达缺失。Weber等报道的94例头颈鳞状细胞癌中仅有10例发现SOCS-3蛋白表达为阳性,且其中9例组织中SOCS-3启动子CpG岛呈超甲基化状态。而将SOCS-3导入CAL-27细胞后发现,过表达的SOCS-3能明显抑制癌细胞生长。Cui等发现肝癌细胞中通过转入SOCS-3可以抑制STAT3的磷酸化,并介导肿瘤细胞死亡。目前认为SOCS基因启动子区域CpG岛的异常高度甲基化是导致基因沉默的主要机制。而已知的SOCS3与JAK/STAT通路相互作用途径主要有3种：①抑制JAK激酶活性阻断JAK/STAT通路；②与细胞因子受体结合,拮抗STAT对活化受体的激活；③通过SOCS盒促进所结合蛋白发生蛋白酶体依赖途径的降解。SOCS-3通过上述机制抑制STAT3磷酸化,负反馈抑制JAK/STAT3信号转导通路,从而抑制了肿瘤的生长。而在与激素分泌相关的肿瘤中,SOCS-3则对肿瘤增殖起到促进作用。但近期对于卵巢癌的研究也提示肿瘤细胞中存在SOCS3,并可进一步激活STAT-3磷酸化,促进肿瘤细胞存活。而对于子宫内膜癌而言,目前尚不确定SOCS家族在其发展中所起的作用。目的：探索子宫内膜癌中SOCS-3的表达情况,以及其对子宫内膜癌HEC-1B细胞系增殖迁移能力的影响,评估SOCS3作为潜在治疗靶点的可能性,探讨其在子宫内膜癌发生发展中的可能机制。从而为子宫内膜癌的发病机制研究奠定基础,为子宫内膜癌的临床预防及治疗提供新的思路。方法：采用免疫组化染色法检测正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中的SOCS3表达情况,分析两者间的表达差异,并进行统计分析。构建SOCS3载体质粒,以慢病毒包装并转染293T细胞扩增病毒,收取病毒液后对子宫内膜癌细胞进行转染以构建SOCS3稳定表达的子宫内膜癌HEC-1B细胞系,以空载体HEC-1B细胞系作为对照。对两组HEC-1B细胞进行单克隆培养,QPCR鉴定SOCS3稳定细胞系SOCS3表达情况。之后分别提取蛋白,BCA法行蛋白定量,SDS电泳转膜后行免疫反应,并利用化学发光进行显影、定影以观察两种细胞中SOCS3的表达情况。之后应用EdU标记法及MTT实验比较SOCS3稳定转染细胞与空载体对照细胞增殖水平,以流式细胞计数比较两者细胞周期情况,并以Transwell法检测两种细胞迁移能力的差别。结果：免疫组化结果提示SOCS3在肿瘤组织中的表达明显低于正常子宫内膜组织,正常子宫内膜组织与子宫内膜癌组织中强阳性表达率分别为90%(18/20)和31.9%(43/135),两组之间差异具有统计学意义(X2=16.860,P0.001)。利用慢病毒包装的SOCS3载体与空载体分别成功转染了两组HEC-1B细胞,对其进行传代培养,荧光染色、QPCR及Western Blot鉴定结果提示SOCS3稳定表达细胞系成功建立。EdU标记法测定提示,与空载体对照组相比,SOCS3稳定表达细胞系EdU标记减少,提示其DNA合成活动减弱,细胞增殖速度低。而MTT实验则进一步支持了这一结论。通过对两组细胞在第1至7天吸光度比较,两者自第5天开始细胞数量出现明显差别,SOCS3稳定表达HEC-1B细胞系细胞数量低于空载体对照组。其差别具有统计学意义。流式细胞仪对细胞周期进行检测提示SOCS3稳定表达细胞多停滞于G0/G1期,S期及G2期细胞数量降低。Transwell实验则进一步提示SOCS3稳定转染细胞迁移能力降低。结论：SOCS3在子宫内膜癌组织中低表达,而在SOCS3稳定表达的子宫内膜癌细胞系中,相比于空载体对照细胞,其增殖能力与迁移能力均有所下降。这一结果提示SOCS3可能在子宫内膜癌中起到抑制癌症发生发展的作用,而子宫内膜癌的发病可能与SOCS3的表达受抑制相关。
【关键词】：SOCS3 子宫内膜癌 细胞增殖 细胞迁移
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 前言14-18
• 第一部分 稳定过表达SOCS3子宫内膜癌细胞株的构建18-45
• 1 实验材料18-22
• 2 实验方法22-24
• 3、酶切位点及PCR引物24-25
• 4、PCR扩增25-28
• 5、SOCS3基因扩增产物酶切,载体酶切,连接,转化28-29
• 6、人SOCS3基因克隆鉴定29
• 7、质粒提取29-31
• 8、慢病毒制备31-35
• 9、病毒液感染人HEC-1B子宫内膜腺癌细胞35-36
• 10、稳定细胞系检测36-40
• 11、WESTERN BLOT验证40-41
• 12、实验结果41-45
• 第二部分 SOCS3基因对子宫内膜癌细胞功能的影响45-56
• 1、实验材料45-47
• 2、实验方法47-50
• 3、统计学分析50
• 4、实验结果50-56
• 全文讨论56-65
• 参考文献65-73
• 全文总结73-75
• 缩写词简表75-78
• 攻读学位期间成果78-79
• 致谢79-81

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