MicroRNAs调控胸部肿瘤中PLK1、BMI1和DAB2基因的分子机制及生物学功能的研究

发布时间：2017-07-14 22:42

  本文关键词：MicroRNAs调控胸部肿瘤中PLK1、BMI1和DAB2基因的分子机制及生物学功能的研究

  更多相关文章： mi RNAs 非小细胞肺癌 食管癌 PLK1 BMI1 DAB2

【摘要】：目的:肺癌和食管癌目前成为胸部肿瘤研究的热点,在我国的发病率一直居高不下,尤其是近年来肺癌的发病率增长速度急剧增加,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占85%以上。食管癌是原发于食管的恶性肿瘤,主要以食管鳞癌(ESCC)为主。肺癌与食管癌早期症状不明显,绝大多数患者就诊时已是中晚期,所以缺乏早期的诊断标记物是目前肺癌和食管癌高死亡率的主要原因。Polo样激酶1(Polo-like kinase1,PLK1)是一种细胞周期调节分子,在有丝分裂过程中起重要作用。BMI1作为多梳基因家族的一种关键癌基因,参与细胞的自我更新和增殖,对调节上皮间质转化(EMT)和促进肿瘤转移具有重要作用。DAB2蛋白是一种广泛表达的细胞内吞适配器,在多种细胞信号转导中发挥主要作用,DAB2在多种癌症中表达下降或缺失,在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。Micro RNAs(mi RNAs)是一类短链非编码RNAs,通过对基因转录后抑制调节基因的表达。许多研究表明mi RNAs在非小细胞肺癌(NSCLC)和食管鳞癌(ESCC)中表达异常并在肿瘤的发生和发展中起重要作用。本课题旨在探讨胸部肿瘤中PLK1、BMI1和DAB2异常表达的mi RNAs调控机制,为胸部肿瘤的早期诊断和治疗提供确凿的实验依据。方法:一.在非小细胞肺癌中mi R-296-5p通过靶向调控PLK1抑制细胞增殖1.运用生物信息学方法预测及验证具有靶向调控PLK1的mirco RNAs通过生物信息学软件Target Scan、Pic Tar和mir Base对直接调控PLK1的II mirco RNAs进行预测。查找mi R-296-5p的成熟体序列并合成mi R-296-5p的模拟体mimics瞬时转染A549细胞,利用Western blot检测转染前后PLK1蛋白表达变化。预先将mi R-296-5p mimics和含PLK1-3’UTR的双荧光素酶报告载体共转染NSCLC细胞,运用双荧光素酶活性实验检测mi R-296-5p是否与PLK1 3’UTR区域的种子序列直接结合。2.mi R-296-5p通过靶向调控PLK1影响NSCLC细胞的生物学功能用实时荧光定量PCR(q PCR)的方法检测临床病人NSCLC组织和癌旁组织中PLK1 m RNA和mi R-296-5p的相对表达量。选取人正常支气管上皮细胞HBE和5株肺癌细胞(A549、95C、95D、LTEP-α-2和H1299)用Western blot的方法检测PLK1的蛋白表达水平,同时用q PCR方法检测mi R-296-5p的相对表达量。用mi R-296-5p mimics和PLK1-si RNA分别转染NSCLC细胞,通过CCK-8和Ed U方法检测上述基因对NSCLC细胞增殖的影响;二.在非小细胞肺癌中mi R-203通过靶向调控BMI1抑制细胞增殖和侵袭1.运用生物信息学方法预测及验证具有靶向调控BMI1的mirco RNAs通过生物信息学软件Target Scan、Pic Tar和mir Base对直接调控BMI1的mirco RNAs进行预测。查找mi R-203的成熟体序列并合成mi R-203的模拟体mimics瞬时转染LTEP-α-2细胞,利用Western blot检测转染前后BMI1蛋白表达变化。运用双荧光素酶活性实验检测mi R-203是否与BMI1 3’UTR区域的种子序列直接结合。2.mi R-203通过靶向调控BMI1影响NSCLC细胞的生物学功能用实时荧光定量PCR(q PCR)的方法检测临床病人NSCLC组织和癌旁组织中BMI1m RNA和mi R-203的相对表达量。选取人正常支气管上皮细胞HBE和6株肺癌细胞(A549、H1650、H226、H1299、H460和LTEP-α-2)用Western blot的方法检测BMI1的蛋白表达水平。用mi R-203 mimics和BMI1-si RNA分别转染NSCLC细胞,通过CCK-8和Ed U方法检测上述基因对NSCLC细胞增殖的影响。用Transwell试验检测mi R-203和BMI1对NSCLC细胞侵袭能力的影响,流式细胞仪检测mi R-203和BMI1对NSCLC细胞凋亡的作用。三.在食管鳞癌中mi R-93通过靶向调控DAB2促进细胞增殖和侵袭1.运用生物信息学方法预测及验证具有靶向调控DAB2的mirco RNAs通过生物信息学软件Target Scan对直接调控DAB2的mirco RNAs进行预测。查找mi R-93的成熟体序列并合成mi R-93的模拟体mimics瞬时转染EC109细胞,利用Western blot检测转染前后DAB2蛋白表达变化。运用双荧光素酶活性实验检测mi R-93是否与DAB2-3’UTR区域的种子序列直接结合。2.mi R-93通过靶向调控DAB2影响ESCC细胞的生物学功能用实时荧光定量PCR(q PCR)的方法检测临床病人NSCLC组织和癌旁组织中DAB2 m RNA和mi R-93的相对表达量。用mi R-93 mimics和DAB2-si RNA分别转染ESCC细胞,通过CCK-8和Ed U方法检测上述基因对ESCC细胞增殖的影响。流式细胞仪检测mi R-93和DAB2对ESCC细胞周期的影响。用Transwell试验检测mi R-93和DAB2对ESCC细胞侵袭能力的影响。四.在食管鳞癌中mi R-218通过靶向调控BMI1抑制细胞增殖和迁移1.运用生物信息学方法预测及验证具有靶向调控BMI1的mirco RNAs通过生物信息学软件Target Scan、Pic Tar和mir Base对直接调控BMI1的mirco RNAs进行预测。查找mi R-218的成熟体序列并合成mi R-218的模拟体mimics瞬时转染EC109细胞,利用Western blot检测转染前后BMI1蛋白表达变化。运用双荧光素酶活性实验检测mi R-218是否与BMI1 3’UTR区域的种子序列直接结合。2.mi R-218通过靶向调控BMI1影响ESCC细胞的生物学功能用实时荧光定量PCR(q PCR)的方法检测临床病人ESCC组织和癌旁组织中mi R-218和BMI1m RNA的相对表达量。用正常食管上皮细胞(HEEC)作为对照,通过q PCR试验检测mi R-218和BMI1 m RNA在ESCC细胞中的表达情况。用mi R-218mimics和BMI1-si RNA分别转染ESCC细胞,通过CCK-8和Ed U方法检测上述基因对ESCC细胞增殖的影响。用Transwell试验检测mi R-218和BMI1对ESCC细胞迁移和侵袭能力的影响。流式细胞仪检测mi R-218和BMI1对ESCC细胞凋亡的作用。合成过表达BMI1(不含3’UTR)质粒,构建过表达BMI1的ESCC细胞株,转染mi R-218mimics后,检测BMI1蛋白表达量的变化及对细胞表型的影响。结果:一.在非小细胞肺癌中mi R-296-5p通过靶向调控PLK1抑制细胞增殖1.mi R-296-5p靶向结合PLK1-3’UTR区域调控PLK1的蛋白表达。用mi R-296-5p mimics转染NSCLC细胞,Western blot显示PLK1蛋白表达量较对照组明显下降。运用生物信息学软件预测mi R-296-5p与PLK1-3’UTR的结合位点。用双荧光素酶活性实验检测结果发现mi R-296-5p与PLK1-3’UTR区域的种子序列直接结合。2.mi R-296-5p通过靶向调控PLK1影响NSCLC细胞的生物学功能在NSCLC组织中,PLK1的m RNA表达水平较癌旁组织明显升高(P0.01),而mi R-296-5p的表达水平较癌旁组织明显下降(P0.01)。与HBE细胞株相比PLK1的蛋白表达量在NSCLC细胞株中明显上升,而mi R-296-5p的表达量在NSCLC细胞株中均下降。用mi R-296-5p mimics和PLK1-si RNA瞬时转染NSCLC细胞株,通过CCK-8和Ed U方法检测细胞增殖,结果显示过表达mi R-296-5p和下调PLK1表达均能抑制NSCLC细胞的增殖。二.在非小细胞肺癌中mi R-203通过靶向调控BMI1抑制细胞增殖和侵袭1.mi R-203靶向结合BMI1-3’UTR区域调控BMI1的蛋白表达。用mi R-203 mimics转染NSCLC细胞,Western blot显示BMI1蛋白表达量较对照组明显下降。运用生物信息学软件预测mi R-203与BMI1-3’UTR的结合位点。用双荧光素酶活性实验检测结果发现mi R-203与BMI1-3’UTR区域的种子序列直接结合。2.mi R-203通过靶向调控BMI1影响NSCLC细胞的生物学功能在NSCLC组织中BMI1m RNA表达水平较癌旁组织明显上升(P0.01),而mi R-203的表达水平较癌旁组织明显下降(P0.01)。与HBE细胞株相比BMI1的蛋白表达量在NSCLC细胞株中明显上升。用mi R-203 mimics和BMI1-si RNA瞬时转染NSCLC细胞株,CCK-8和Ed U方法检测细胞增殖,结果显示过表达mi R-203和下调BMI1表达均能抑制NSCLC细胞增殖。用mi R-203 mimics和BMI1-si RNA瞬时转染NSCLC细胞株,流式细胞仪检测显示过表达mi R-203或下调BMI1的表达均能促进细胞凋亡。用mi R-203 mimics和BMI1-si RNA瞬时转染NSCLC细胞株,侵袭实验表明过表达mi R-203或下调BMI1表达均能抑制细胞侵袭能力。三.在食管鳞癌中mi R-93通过靶向调控DAB2促进细胞增殖和侵袭1.mi R-93靶向结合DAB2-3’UTR区域调控DAB2的蛋白表达。用mi R-93 mimics转染ESCC细胞,Western blot显示DAB2蛋白表达量较对照组明显下降。运用生物信息学软件预测mi R-93与DAB2-3’UTR的结合位点。用双荧光素酶活性实验检测结果发现mi R-93与DAB2-3’UTR区域的种子序列直接结合。2.mi R-93通过靶向调控DAB2影响ESCC细胞的生物学功能在ESCC组织中DAB2 m RNA表达水平较癌旁组织明显下降(P0.01),而mi R-93的表达水平较癌旁组织明显上升(P0.05)。用mi R-93 mimics和DAB2-si RNA瞬时转染ESCC细胞株,CCK-8和Ed U方法检测细胞增殖,结果显示过表达mi R-93和下调DAB2表达均能促进ESCC细胞的增殖。用mi R-93 mimics和DAB2-si RNA瞬时转染ESCC细胞株,流式细胞仪检测显示过表达mi R-93或下调DAB2的表达均能促进细胞周期。用mi R-93 mimics和DAB2-si RNA瞬时转染ESCC细胞株,侵袭实验表明过表达mi R-93或下调DAB2表达均能促进细胞侵袭能力。四.在食管鳞癌中mi R-218通过靶向调控BMI1抑制细胞增殖和迁移1.mi R-218靶向结合BMI1-3’UTR区域调控BMI1的蛋白表达用mi R-218 mimics转染ESCC细胞,Western blot显示BMI1蛋白表达量较对照组明显下降。运用生物信息学软件预测mi R-218与BMI1-3’UTR的结合位点。用双荧光素酶活性实验检测结果发现mi R-218与BMI1-3’UTR区域的种子序列直接结合。2.mi R-218通过靶向调控BMI1影响ESCC细胞的生物学功能在ESCC组织中mi R-218表达水平较癌旁组织明显下降(P0.01),而BMI1m RNA的表达水平较癌旁组织明显上升(P0.01)。与HEEC细胞株相比mi R-218表达量在ESCC细胞株中明显下降。用mi R-218mimics和BMI1-si RNA瞬时转染ESCC细胞株,CCK-8和Ed U方法检测结果显示过表达mi R-218和下调BMI1表达均能抑制ESCC细胞的增殖;流式细胞仪检测显示过表达mi R-218或下调BMI1的表达均能促进细胞凋亡;侵袭实验表明过表达mi R-218或下调BMI1的表达均能抑制细胞的侵袭能力。用mi R-218 mimics转染过表达PLK1但不含3’UTR质粒的ESCC细胞株,Western blot显示mi R-218下调BMI1的蛋白表达,但这种下调结果可被转染PLK1质粒恢复。同时mi R-218诱导的抑制ESCC的细胞增殖、细胞划痕和细胞侵袭的效果可被过表达PLK1的质粒恢复。结论:1.mi R-296-5p通过靶向结合PLK1抑制NSCLC细胞的增殖。2.mi R-203通过靶向结合BMI1抑制NSCLC细胞增殖、侵袭和促进细胞凋亡。3.mi R-93通过靶向调节DAB2的蛋白表达促进ESCC细胞的增殖和侵袭并促进细胞周期。4.mi R-218通过靶向调节BMI1的蛋白表达抑制ESCC细胞增殖和侵袭能力,同时促进细胞的凋亡。
【关键词】：mi RNAs 非小细胞肺癌 食管癌 PLK1 BMI1 DAB2
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1;R734.2
【目录】：

• 中文提要4-10
• Abstract10-21
• 前言21-26
• 第一部分 在非小细胞肺癌中mi R2965p通过靶向调控PLK1抑制细胞增殖26-50
• 1. 材料26-31
• 1.1 细胞株及组织样本26-27
• 1.2 仪器及试剂27-29
• 1.3 试剂配制方法29-31
• 2. 研究方法及步骤31-39
• 2.1 生物信息学方法31-32
• 2.2 细胞培养32-33
• 2.3 细胞总RNA的提取和逆转录c DNA的合成33-34
• 2.4 实时定量PCR（q PCR）34-35
• 2.5 统计分析 Real-Time PCR 结果35-36
• 2.6 瞬时转染细胞36
• 2.7 双荧光素酶报告基因活性检测36-37
• 2.8 重组质粒的构建37
• 2.9 生物信息学软件和数据库37-38
• 2.10 CCK-8 法检测细胞增殖38
• 2.11 Ed U法检测细胞增殖38-39
• 3. 结果39-47
• 3.1 初次筛选39
• 3.2 对初次筛选的mi RNAs进行验证39-40
• 3.3 mi RNAs与目的基因 3’UTR区域的种子序列直接结合40-42
• 3.4 在NSCLC组织中mi R2965p通过靶向调控PLK1影响NSCLC细胞的生物学功能42-47
• 4．讨论47-50
• 第二部分 在非小细胞肺癌中mi R-203通过靶向调控BMI1抑制细胞增殖和侵袭50-67
• 1. 材料51-52
• 1.1 细胞株及组织样本51
• 1.2 仪器及试剂51-52
• 1.3 试剂配制方法52
• 2. 研究方法及步骤52-55
• 2.1 生物信息学方法52
• 2.2 逆转录c DNA的合成和实时定量PCR（q PCR）52-53
• 2.3 统计分析Real-Time PCR结果53
• 2.4 双荧光素酶报告质粒构建53
• 2.5 双荧光素酶报告基因活性检测53-54
• 2.6 Transwell试验检测细胞的侵袭能力54-55
• 2.7 流式细胞仪技术检测细胞凋亡55
• 3. 结果55-65
• 3.1 初次筛选55-56
• 3.2 对初次筛选的mi RNAs进行验证56-57
• 3.3 mi R-203通过和基因 3’UTR区域的种子序列直接结合来抑制BMI1基因的表达。57-59
• 3.4 在NSCLC组织中，mi R-203通过靶向调控BMI1影响NSCLC细胞的生物学功能。59-65
• 4. 讨论65-67
• 第三部分 在食管鳞癌中mi R-93通过靶向调控DAB2抑制细胞增殖和迁移67-86
• 1. 材料68-69
• 1.1 细胞株及组织样本68
• 1.2 仪器及试剂68
• 1.3 试剂配制方法68-69
• 2. 研究方法及步骤69-73
• 2.1 生物信息学方法69
• 2.2 逆转录c DNA的合成和实时定量PCR（q PCR）69-70
• 2.3 统计分析Real-Time PCR结果70
• 2.4 双荧光素酶报告质粒的构建70-72
• 2.5 细胞周期检测72-73
• 3. 结果73-83
• 3.1 初次筛选73
• 3.2 对初次筛选的mi RNAs进行验证73-74
• 3.3 mi R-93通过和基因 3’UTR区域的种子序列直接结合来抑制BMI1基因的表达。74-77
• 3.4 在ESCC组织中，mi R-93通过靶向调控DAB2影响ESCC细胞的生物学功能。77-83
• 4. 讨论83-86
• 第四部分 在食管鳞癌中mi R-218通过靶向调控BMI1抑制细胞增殖和迁移86-109
• 1. 材料87-88
• 1.1 细胞株及组织样本87
• 1.2 仪器及试剂87
• 1.3 试剂配制方法87-88
• 2. 研究方法及步骤88-93
• 2.1 生物信息学方法88
• 2.2 逆转录c DNA的合成和实时定量PCR(q PCR)88-89
• 2.3 统计分析Real-Time PCR结果89
• 2.4 双荧光素酶报告质粒的构建89-90
• 2.5 过表达BMI载体的构建90-91
• 2.6 双荧光素酶报告基因活性检测91-92
• 2.7 细胞划痕实验92-93
• 3. 结果93-108
• 3.1 初次筛选93
• 3.2 对初次筛选的mi RNAs进行验证93-94
• 3.3 mi R-218通过和基因 3’UTR区域的种子序列直接结合来抑制BMI1基因的表达。94-97
• 3.4 在ESCC组织中，，mi R-218通过靶向调控BMI1影响ESCC细胞的生物学功能。97-108
• 4. 讨论108-109
• 小结109-110
• 参考文献110-121
• 综述 micro RNA在NSCLC中的研究进展121-133
• 参考文献128-133
• 英文缩略词表133-134
• 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文134-135
• 致谢135-137

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Kumar Anupam;Chatopadhyay Tusharkant;Siddhartha Datta Gupta;Ralhan Ranju;;Loss of disabled-2 expression is an early event in esophageal squamous tumorigenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2006年37期

本文编号：542564