循环miRNA内参的筛选及验证

发布时间：2017-08-05 11:03

  本文关键词：循环miRNA内参的筛选及验证

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【摘要】：[目的]通过对不同肿瘤患者和健康对照者血清中微小RNA(micro RNA,mi RNA)表达情况进行检测,并在血浆样本中进行验证,筛选出表达稳定、检测方便、适合作为内参的循环mi RNA,为循环mi RNA肿瘤标志物的筛选及后续研究提供可靠的内参基因。[方法]采用高通量微阵列芯片技术,分别对20例鼻咽癌(Nasophary ngeal cancer,NPC)患者,20例健康对照血清,10例胃癌(Gastric Cancer,GC)患者、10例健康对照血清等体积混合后,对混合血清中mi RNA表达谱进行分析,结合大量文献数据,筛选出其中表达水平较高、稳定性较好的mi RNA作为候选循环mi RNA内参。采用实时荧光定量PCR技术,在上述30例肿瘤患者和30例健康对照者血清中对初步筛选出的mi RNA的表达水平进行验证,同时对U6和mi R-16作为内参的适用性进行分析,并利用Ge Norm软件对候选内参基因分子进行计算分析,排除部分表达水平较低或者表达稳定性较差的循环mi RNA后,得到表达最稳定mi RNA。另选取50例健康人及178例肿瘤患者(胃癌68例、结肠癌(Colon Cancer)、直肠癌(Rectal Cancer)、乳腺癌(Breast Cancer,BC)各30例、鼻咽癌20例)血清,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q PCR)技术对初筛的内参基因表达水平进行验证;结合Ge Norm软件、Norm Finder软件、Best Keeper软件进行综合分析计算,验证所筛选内参基因的可靠性及稳定性。进一步验证所筛选内参基因在不同冻融次数下表达稳定性。在血浆中对筛选的循环mi RNA内参的表达稳定性进行验证。[结果]高通量微阵列芯片结果显示,在鼻咽癌、胃癌和健康对照者组血清中,经初步筛选其中共有6个mi RNA符合内参筛选要求,分别为hsa-mi R-191-5p,hsa-mi R-24-3p,hsa-mi R-142-3p,hsa-mi R-186-5p,hsa-mi R-135a*-3p,hsa-mi R-19b-3p。根据鼻咽癌与非癌人群的mi RNA表达谱芯片分析和实时荧光定量PCR发现U6在不同人群中表达存在较大波动,反复冻融后表达量亦有所降低,证实了U6不适合作为循环mi RNA内参。经初次q PCR验证hsa-mi R-135a*-3p基因表达水平CV值(cycle value,CV)(也叫CT值)中位数大于35被排除,剩余的5个mi RNA被纳入进一步分析。应用Ge Norm软件对上述5个候选内参基因稳定性进行计算分析,结合其在不同样本中的表达水平,初步筛选出可能的mi RNA内参基因为hsa-mi R-191-5p,hsa-mi R-24-3p,hsa-mi R-142-3p。经一定量的样本再次q PCR验证初筛的mi RNA内参和文献报道的可能的循环mi RNA内参,结合Ge Norm软件、Norm Finder软件、Best Keeper软件进行综合分析计算,结果证实mi R-191和mir-24的表达最为稳定,优于文献报道的其他候选循环mi RNA内参。在血清反复冻融情况下,mi R-191和mir-24表达较为稳定。mi R-191和mir-24在血浆样品中表达同样比较稳定,提示其同样适用于作为血浆mi RNA的内参。[结论]U6不适合作为循环mi RNA内参;hsa-mi R-191-5p和has-mi R-24-3p适合作为循环mi RNA内参。
【关键词】：循环mi RNA 内参基因 肿瘤 q-PCR 归一化
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.43
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-18
• 第2章 实验材料18-22
• 2.1 主要实验仪器18
• 2.2 主要实验试剂及材料18-20
• 2.3 溶液的配制20-22
• 第3章 实验方法22-30
• 3.1 血液样本的收集22
• 3.2 血清总RNA的提取、纯化22-24
• 3.3 逆转录24-25
• 3.4 高通量微阵列芯片检测血清miRNA表达谱25-26
• 3.5 引物的设计和合成26-27
• 3.6 实时荧光定PCR27-28
• 3.7 数据筛选和统计分析28-30
• 第4章 实验结果30-42
• 4.1 收集不同肿瘤患者血清及对照组健康人群血清，完善个人资料和临床资料，初步建立完善血清样本库30-31
• 4.2 U6和miR16作为内参的适用性分析31-34
• 4.3 高通量微阵列芯片分析初步筛选候选内参mi RNA34
• 4.4 候选内参miRNA初步筛选34-36
• 4.5 扩大样本进一步筛选并验证循环miRNA内参36-38
• 4.6 冻融次数对各候选miRNA内参基因的影响38-39
• 4.7 筛选出的循环miRNA内参在血浆中进行稳定性验证39-42
• 第5章 讨论42-50
• 第6章 结论50-52
• 参考文献52-60
• 文献综述60-72
• 参考文献65-72
• 作者攻读学位期间的科研成果72-74
• 本研究基金资助项目74-76
• 致谢76-77

【共引文献】

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1 Lin Zhu;Xiu-Hua Qu;Yu-Lin Sun;Yang-Ming Qian;Xiao-Hang Zhao;;Novel method for extracting exosomes of hepatocellular carcinoma cells[J];World Journal of Gastroenterology;2014年21期

2 Marco Ragusa;Cristina Barbagallo;Luisa Statello;Angelo Giuseppe Condorelli;Rosalia Battaglia;Lucia Tamburello;Davide Barbagallo;Cinzia Di Pietro;Michele Purrello;;Non-coding landscapes of colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2015年41期

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本文编号：624527