DC疫苗联合麻腮风佐剂对乳腺癌荷瘤小鼠免疫治疗的研究

发布时间：2017-08-09 10:30

  本文关键词：DC疫苗联合麻腮风佐剂对乳腺癌荷瘤小鼠免疫治疗的研究

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【摘要】：众所周知,在女性群体中,乳腺癌是发病率最高的一种癌症,且近年来的发病率还在不断上升。原位的乳腺癌并不会危及生命,但癌细胞一旦转移到其他组织就会有致命的危险。随着对乳腺癌认识的不断深入,乳腺癌治疗理念也不断更新,治疗方法也更加多元化,其中免疫治疗是近来年癌症研究最为活跃的领域之一,可以通过对癌细胞的主动治疗来实现消灭其的目的。树突状细胞(Dendritic cells, DC)是目前为止所发现的最强有力的抗原呈递细胞,同时也是体内仅有的能够激活原初型T细胞的免疫细胞。人体内树突状细胞的数目很少,且由于成熟度低导致功能受到了抑制。随着对DC研究的不断详尽,DC体外扩增培养技术也日趋成熟,为临床上使用DC疫苗进行肿瘤的免疫治疗提供了依据。免疫佐剂,别称非特异性免疫增生剂,当其同负载抗原DC疫苗提前或者一起注射进入机体内时,免疫佐剂可以增强抗原的免疫原性,使机体产生高效、持久并具有记忆性的免疫应答。本实验旨在寻找到一种新型佐剂,增进负载肿瘤抗原的DC疫苗的免疫学功能,为临床上针对乳腺癌的免疫治疗奠定实验基础。本文拟采用的免疫佐剂是麻腮风联合减毒活疫苗(Measles,Mumps and Rubella combined vaccine),它是目前中国广泛用于预防麻疹、流行性腮腺炎、风疹三种儿童常见呼吸道传染病的疫苗。[目的]探讨DC疫苗联合麻腮风佐剂对实验动物Balb/c荷瘤鼠的免疫治疗能否有效果。1.用乳腺癌4T1细胞裂解物致敏DC疫苗,研究4T1细胞裂解物对DC疫苗成熟度的影响；2.建立小鼠乳腺癌原位模型,探讨麻腮风佐剂联合DC疫苗对小鼠的乳腺癌能否有治疗效果；3.按照不同方式用麻腮风佐剂免疫小鼠,研究麻腮风提前免疫和麻腮风联合DC疫苗实时治疗对荷瘤小鼠免疫格局的影响。[方法]1.用含10%FBS的RPMI-1640培养基来培养小鼠乳腺癌4T1细胞,并采用液氮、37℃反复冻融的方法制备4T1细胞裂解液。2.从Balb/c小鼠骨髓中提取出骨髓细胞悬液,经红细胞裂解液处理后,将剩下的单核细胞用含12%FBS的RPMI-1640培养基培养,培养基中加入终浓度均为10ng/ml的细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4刺激分化,用10ng/ml的细胞因子rmTNF-α刺激DC成熟。3.用4T1肿瘤细胞裂解液致敏DC细胞,制作负载肿瘤抗原的DC疫苗。4.在小鼠皮下乳房垫处原位种植4T1细胞5×104个,建立小鼠乳腺癌荷瘤模型。5.在不同的时间点用麻腮风免疫Balb/c小鼠。治疗组：在接种4T1肿瘤细胞7天、14天、21天各进行一次治疗,每只小鼠背部皮下注射50 μ l麻腮风疫苗工作液,同时在腋下淋巴结附近接种负载肿瘤抗原DC疫苗1×106个。回忆应答组：在接种4T1肿瘤细胞前28天给小鼠进行麻腮风免疫,每只小鼠背部皮下注射50 μ l麻腮风疫苗工作液,14天后加强一次,接着给每只小鼠接种4T1肿瘤细胞,接种7天、14天、21天各进行一次治疗,每只小鼠背部皮下注射50 μ l麻腮风疫苗工作液,同时在腋下淋巴结附近接种负载肿瘤抗原DC疫苗1×106个。每天观察小鼠肿瘤生长状况,比较其肿瘤体积以及小鼠的生存时间。6.小鼠经心脏穿刺取血,4℃静置过夜,3OOOr/min离心10min,分离出血清备用。用Elisa试剂盒检测血清中细胞因子IL-12、TNF-α的含量。7.处死小鼠后取出瘤体,称重,并计算各组相对于对照组的抑瘤率。[结果]1.用4T1肿瘤细胞裂解液致敏的DC细胞具有典型的形态学特征。2.所有组别的Balb/c小鼠在接种5×101个4T1细胞后,100%成瘤。小鼠的生存周期为4-14周。3.麻腮风联合DC疫苗治疗组和麻腮风联合DC疫苗回忆应答组小鼠肿瘤体积显著低于对照组,且小鼠生存时间延长。4.麻腮风联合DC疫苗治疗组和麻腮风联合DC疫苗回忆应答组小鼠肿瘤重量显著低于对照组,且抑瘤率分别达到46%和71%。5.麻腮风联合DC疫苗治疗组和麻腮风联合DC疫苗回忆应答组小鼠血清中IL-12、TNF-α水平显著高于对照组,且麻腮风联合DC疫苗回忆应答组小鼠血清中IL-12、TNF-α水平最高。结论：麻腮风联合减毒活疫苗联合DC疫苗能促进细胞因子IL-12、TNF-α的分泌,减缓小鼠肿瘤的生长速度,延长小鼠的生存时间。提示麻腮风减毒活疫苗可以作为一种新型佐剂应用于乳腺癌的免疫治疗上。
【关键词】：乳腺癌 免疫治疗 树突状细胞 DC疫苗 免疫佐剂 麻腮风减毒活疫苗 细胞因子
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 中英文缩略词表12-14
• 前言14-22
• 1. 乳腺癌的免疫逃逸机制14-15
• 2. DC的来源及生物学特征15-16
• 3. DC的成熟16-17
• 4. DC及对抗原的摄取加工及呈递17
• 5. DC的抗肿瘤免疫机制17-18
• 6. DC疫苗18-20
• 7. 免疫佐剂20-22
• 材料和方法22-33
• 1. 材料22-24
• 1.1 实验细胞及动物22
• 1.2 仪器与设备22-23
• 1.3 药品与试剂23
• 1.4 其他耗材23
• 1.5 溶液的配置23-24
• 2. 实验方法24-33
• 2.1 4T1细胞的复苏24
• 2.2 4T1细胞的传代培养24-25
• 2.3 细胞计数25
• 2.4 台盼蓝染色25
• 2.5 4T1细胞的冻存25-26
• 2.6 4T1细胞裂解液的制备26
• 2.7 小鼠骨髓源树突状细胞的分离培养26-28
• 2.8 荷瘤小鼠模型的建立28-29
• 2.9 Balb/c小鼠的分组及免疫治疗29-31
• 2.10 小鼠血清中IL-12和TNF-α含量的测定31-33
• 结果33-46
• 1. 体外培养4T1细胞的生长状况33
• 2. DC的形态观察33-36
• 3. 荷瘤小鼠乳腺癌模型36-37
• 4. 荷瘤小鼠肿瘤的生长状况37-40
• 5. 麻腮风联合DC疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗效果40-42
• 6. 免疫治疗后小鼠血清中的细胞因子IL-12和TNF-α的含量42-46
• 讨论46-51
• 1. DC细胞的提取培养46-47
• 2. DC疫苗的制备47-48
• 3. 乳腺癌荷瘤小鼠模型的建立48
• 4. DC疫苗对乳腺癌荷瘤小鼠的免疫治疗48-51
• 结论51-52
• 参考文献52-56
• 致谢56-57

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本文编号：644829