Ovol2基因通过转录抑制Twist1的表达来抑制肺腺癌细胞的EMT过程

发布时间：2021-04-02 20:22

目的：本实验主要研究Ovo12基因对肺腺癌细胞上皮一间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,以下简称EMT)过程及其侵袭力、远处转移能力的影响,并进一步探讨其中可能存在的分子机制,以期为肺腺癌的靶向治疗提供一定的理论基础。方法：第一部分实验我们以临床手术切除标本为基础,通过免疫组化(Immunohistochemistry)实验,我们检测不同分期、不同分化程度及癌旁组织中Ovo12蛋白的表达水平,明确Ovo12的表达水平是否会有差异。第二部分细胞学实验均通过培养肺腺癌细于体外完成。培养肺腺癌细胞株A549,通过构建并感染PLV-BSD-Ovol2(过表达Ovo12)及PLV-BSD-Control慢病毒形成实验组(过表达Ovol2)和对照组；首先,通过实时荧光定量PCR实验(Quant it ative Real-time PCR,以下简称Real-time PCR)检测实验组、对照组细胞中与EMT相关基因的mRNA表达水平变化,明确Ovo12过表达后是否能够在mRNA水平抑制抑制与EMT相关基因的表达；进一步,我们采用Western-Blot蛋白印记实验检测上皮细胞与间充质细胞的相关标记蛋白,如E-钙黏蛋白(E-cadherin)、 N-钙黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)等的蛋白表达水平,从而进一步明确是否被Ovol2所抑制；更进一步,我们通过染色质免疫共沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation,以下简称ChIP)、荧光素酶实验(Luciferase Reporter Gene Assays,以下简称LUC实验)及拯救实验(rescue实验)来进一步探究其可能的分子机制。最后,我们通过划痕实验(Wound Healing)及侵袭实验(Transwell)比较实验组和对照组细胞的转移和侵袭能力的变化,从直观上直接观察细胞侵袭及转移能力的变化。结果：Ovol2基因过表达后,不论在mRNA还是在蛋白表达水平,E-钙黏蛋白表达上升,N-钙黏蛋白及波形蛋白表达下降；如若进一步同时将被Ovo12基因明显抑制的转录因子Twistl过表达后,这种抑制作用会被部分抵消。而且,Ovo12可以直接结合与转录因子Twist1的启动子序列,从而来调控(抑制)其表达,这种抑制作用是一种剂量依赖性的；最后肺癌细胞的转移和侵袭能力也相应的被抑制。结论：Ovo12基因可以通过直接抑制转录因子Twistl的表达来抑制肺腺癌细胞的EMT过程,从而抑制其远处转移及侵袭力。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

文章目录

主要缩略语及中英文对照表

摘要

Abstract

1、前言

2、材料和方法

2.1、材料

2.2、实验方法

3、结果

3.1、肺腺癌细胞中Ovol2过表达抑制EMT相关基因的表达在

3.2、Ovol2基因通过直接抑制转录因子Twist1的表达抑制肺腺癌细胞的EMT过程

3.3、Ovol2基因抑制转录因子Twist1的表达存在剂量依赖性