番茄SlGAMYBL2基因克隆及非生物胁迫中的功能分析

发布时间：2023-12-19 07:58

　　番茄常用于植物科学研究,是重要模式植物之一,也是我国重要的蔬菜作物。全球气候变暖、水资源短缺以及设施栽培中土壤盐渍化造成的高盐、低温、高温、干旱等非生物胁迫因子影响着番茄生长发育和生产力。从分子生物学的角度阐明植物抗逆性基因的功能成为了改良植物抗逆性的重要基础。GAMYB是GA信号应答途径中的一个转录因子。GAMYB也受到胁迫激素ABA(abscisicacid)的调控。然而在番茄中GAMYB是否能提高植物的胁迫抗性鲜有报道。本研究克隆了番茄中GAMYB同源基因SlGAMYBL2,在烟草植株中异源超表达,并对转基因烟草进行表型鉴定和生理生化分析,研究番茄SlGAMYBL2在非生物胁迫中的功能,结果如下:1.SlGAMYBL2具有GAMYB典型的R2R3 DNA结构域,C端具有2个特殊的保守区域(BOX1,BOX2),从MEGA软件构建的进化树同样可以看出,SlGAMYBL2编码的蛋白属于GAMYB家族,与大麦HvGAMYB亲缘性较高。通过对其上游序列分析,除了发现具有典型的启动子核心序列外,还具有能响应非生物胁迫的顺式作用元件。2.利用DNA重组技术成功构建了 35S启动子驱动SlGA...

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩列表
技术路线图
1 前言
    1.1 研究背景
    1.2 番茄的研究进展
        1.2.1 番茄抗冷性的研究
        1.2.2 番茄抗旱性的研究
        1.2.3 番茄耐盐性的研究
    1.3 MYB转录因子的研究概况
    1.4 GAMYB的研究概况
        1.4.1 GAMYB在种子萌发中的作用
        1.4.2 GAMYB在开花诱导中的作用
        1.4.3 GAMYB在花药发育中的作用
        1.4.4 GAMYB在激素信号途径中的作用
        1.4.5 GAMYB互作蛋白
        1.4.6 参与GAMYB调控的相关基因miR159
    1.5 研究的内容以及选题的意义与目的
        1.5.1 研究的内容
        1.5.2 选题的意义
        1.5.3 选题的目的
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌种及载体
        2.1.3 试剂
        2.1.4 仪器设备
        2.1.5 培养基的配方
    2.2 方法
        2.2.1 SlGAMYBL2进行生物信息学分析
        2.2.2 SlGAMYBL2在番茄中组织表达模式分析
            2.2.2.1 番茄材料的处理
            2.2.2.2 番茄总RNA的提取
            2.2.2.3 电泳检测RNA
            2.2.2.4 反转录合成cDNA
            2.2.2.5 荧光定量PCR检测基因的表达水平
        2.2.3 中间载体的构建
            2.2.3.1 目的基因的PCR扩增
            2.2.3.2 PCR产物回收
            2.2.3.3 目标片段与pEASY-Blunt克隆载体的连接反应
            2.2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
            2.2.3.5 连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞
            2.2.3.6 菌落PCR对阳性转化子的检测
            2.2.3.7 质粒的提取
            2.2.3.8 质粒的酶切验证
        2.2.4 SlGAMYBL2超表达载体的构建
            2.2.4.1 克隆载体pEASY-SlGAMYBL2和表达载体P35S的双酶切
            2.2.4.2 目的片段与表达载体的连接
            2.2.4.3 连接产物的转化
            2.2.4.4 菌落PCR对阳性转化子的检测
            2.2.4.5 质粒的提取
            2.2.4.6 阳性重组体的鉴定
        2.2.5 遗传转化
            2.2.5.1 根癌农杆菌感受态细胞EHA105的制备
            2.2.5.2 重组质粒转化农杆菌(冻融法)
            2.2.5.3 农杆菌介导的烟草遗传转化
                2.2.5.3.1 无菌苗的获得
                2.2.5.3.2 农杆菌准备
                2.2.5.3.3 叶片的侵染
                2.2.5.3.4 抗性植株筛选
                2.2.5.3.5 生根培养
            2.2.5.4 转基因烟草植株的检测
                2.2.5.4.1 转基因烟草植株的PCR筛选
                2.2.5.4.2 转基因植株的GUS染色鉴定
                2.2.5.4.3 转基因植株的表型分析
        2.2.6 转基因株系的抗逆试验
            2.2.6.1 转基因烟草种子的萌发实验
            2.2.6.3 烟草幼苗非生物胁迫处理
        2.2.7 生理指标测定
            2.2.7.1 电导率的测定
            2.2.7.2 保水性实验
            2.2.7.3 酶液提取
            2.2.7.4 SOD酶测定
            2.2.7.7 过氧化氢酶(CAT)测定
            2.2.7.8 过氧化物酶(POD)测定
            2.2.7.9 丙二醛(MDA)含量测定
3 结果与分析
    3.1 SlGAMYBL2的氨基酸序列对比和进化树分析
    3.2 SlGAMYBL2基因在胁迫和外源激素处理下的表达分析
    3.3 SlGAMYBL2超表达载体的构建
    3.4 SlGAMYBL2超表达载体转化烟草
    3.5 PCR验证转基因植株
    3.6 转基因植株的GUS染色验证
    3.7 表型的分析
    3.8 种子萌发结果分析
    3.9 非生物胁迫处理下烟草幼苗的根长分析
    3.10 非生物胁迫下生理指标的分析
        3.10.1 相对电导率
        3.10.2 丙二醛(MDA)含量测定
        3.10.3 保水性
        3.10.4 超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的测定
        3.10.5 过氧化氢酶(CAT)活性的测定
        3.10.6 过氧化物酶(POD)活性的测定
4 结论与讨论
    4.1 结论
    4.2 讨论
        4.2.1 SlGAMYBL2基因提高了植株的抗逆性
        4.2.2 SlGAMYBL2的氨基酸序列对比和进化树分析
        4.2.3 超表达载体的构建
        4.2.4 转基因植株的获得与表型的鉴定
        4.2.5 超表达SlGAMYBL2提高了转基因烟草细胞膜稳定性
        4.2.6 超表达SlGAMYBL2提高了转基因烟草抗氧化酶活性
    4.3 后续工作的设想
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况



本文编号：3873968