利用CRISPR/Cas9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

发布时间：2024-01-05 19:02

　　随着人类对多个物种全基因组的相继解析,基因的功能性研究愈发重要。从20世纪80年代末兴起的基因打靶技术开始,越来越多的基因编辑技术被应用于基因功能的研究。CRISPR/Cas9基因敲除系统作为一种新型基因操控技术,可以精确、高效的对基因组进行敲除或者修饰,从而更好地完成基因功能研究。aroA基因编码的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是革兰氏阴性菌和阳性菌芳香族氨基酸生物合成途径中重要的酶,缺失该基因可对细菌的毒力产生明显的减弱作用。本研究旨在利用CRISPR/Cas9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异,探讨利用该敲除系统对其它相关细菌aroA基因进行敲除修复的可行性,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。通过比对分析不同大肠杆菌菌株aroA基因及其上下游序列,设计相应引物并构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas9载体；鉴于原核生物大多缺乏非同源末端连接修复机制,可人工设计同源修复供体(Donor)基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas9载体中,构建...

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
常用英文缩略词表
第一章 综述及研究目的与意义
    1 文献综述
        1.1 研究概况
        1.2 CRISPR/Cas系统的发展历史
        1.3 CRISPR/Cas系统的组织结构
        1.4 CRISPR/Cas系统的分类
        1.5 CRISPR/Cas系统的免疫机理
        1.6 CRISPR/Cas系统的应用历程
        1.7 CRISPR/Cas9系统脱靶效应
        1.8 aroA基因的研究进展
    2 本研究的目的和意义
第二章 利用CRISPR/Cas9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用
    1 材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 主要试剂
        1.3 主要实验仪器设备
    2 方法
        2.1 sgRNA的设计和相关引物的合成
        2.2 sgRNA载体的构建
            2.2.1 sgRNA的退火连接
            2.2.2 psgRNA-GFP质粒的酶切
            2.2.3 酶切质粒的纯化回收
            2.2.4 连接反应
            2.2.5 感受态细胞的制备
            2.2.6 转化
            2.2.7 阳性克隆菌的筛选
            2.2.8 重组质粒的PCR鉴定、序列测定
        2.3 aroA基因同源臂(Donor)载体的构建
            2.3.1 大肠杆菌DH10B基因组DNA的提取
            2.3.2 aroA基因同源臂的PCR扩增
            2.3.3 目的基因和质粒的酶切
            2.3.4 目的基因的连接与转化
            2.3.5 阳性克隆的筛选与鉴定
            2.3.6 完整aroA基因Donor载体的构建与鉴定
        2.4 含sgRNA及aroA基因同源臂载体的构建
        2.5 DH5α、DH10B、JM109菌株aroA基因的敲除及筛选
            2.5.1 分步转化
            2.5.2 PCR及克隆鉴定
        2.6 基因缺失菌生长曲线的测定
    3 结果
        3.1 sgRNA的设计
        3.2 sgRNA载体构建结果
        3.3 aroA基因同源臂载体的构建结果
        3.4 psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor载体构建结果
        3.5 对不同大肠杆菌aroA基因敲除效率的检测结果
        3.6 基因缺失菌生长曲线的测定结果
    4 讨论
第三章 结论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3877152