应用CRISPR/Cas9技术构建人参CAS基因和三七DS基因的载体及转化体系建立
发布时间：2024-02-13 20:56
基因编辑技术是一种能够对生物体基因组特定目标基因进行定点修饰的基因工程技术,自问世以来广泛应用于植物育种、群体改良、突变体构建等领域。较大田作物而言,基因编辑技术在药用植物中应用较少。人参和三七为五加科人参属极具药用价值的代表性植物,基因编辑技术的应用对其基因组功能研究、物质合成调控等具有重要意义。本试验基于人参皂苷前体物质2,3-氧化角鲨烯的代谢通路,构建人参环阿乔醇合酶(CAS)和三七达玛烯二醇合成酶(DS)基因CRISPR/Cas9表达载体。以根癌农杆菌转化人参愈伤组织,探究共培养后适宜的抑菌压和筛选压,优化和完善人参愈伤的遗传转化体系。制备产量和活力较高的三七原生质体作为聚乙二醇转导的受体材料。为人参和三七基因编辑体系的建立奠定实验基础。主要研究结果如下:1.以pRGEB32质粒为基本骨架,利用同源重组法将靶序列片段与线性化载体连接,构建人参CAS基因和三七DS基因CRISPR/Cas9编辑载体。将pCRISPR-CAS热激导入EHA105感受态细胞用于人参愈伤组织转化。2.探究不同浓度的头孢霉素和卡那霉素对人参愈伤组织生长的影响,确定农杆菌介导的遗传转化中适宜的抑菌浓度和筛选...
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 基因编辑技术发展历程
1.1.1 ZFN技术简介
1.1.2 TALENs技术简介
1.1.3 归巢核酸酶技术简介
1.1.4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
1.2 CRISPR/Cas9 作用原理及应用
1.2.1 CRISPR/Cas9 作用原理
1.2.2 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术应用
1.3 人参皂苷生物合成路径及目的基因功能
1.3.1 人参皂苷生物合成路径
1.3.2 环阿乔醇合酶基因
1.3.3 达玛烯二醇合酶基因
1.4 研究内容及目的意义
1.4.1 研究内容
1.4.2 研究目的及意义
第二章 CRISPR/Cas9 载体构建及转化
2.1 试验材料
2.2 试验仪器试剂
2.2.1 主要试验仪器
2.2.2 主要试验试剂
2.3 试验方法
2.3.1 sgRNA设计
2.3.2 Oligo二聚体合成连接
2.3.3 质粒转化及保存
2.3.4 质粒提取
2.3.5 质粒转导EHA105农杆菌
2.4 结果与分析
2.4.1 载体构建
2.4.2 质粒转化农杆菌
2.5 讨论
第三章 农杆菌介导的人参愈伤组织转化
3.1 试验材料
3.2 试验仪器试剂
3.2.1 主要试验仪器
3.2.2 主要试剂
3.3 试验方法
3.3.1 愈伤组织继代培养
3.3.2 Cef对人参愈伤组织生长的影响
3.3.3 Cef对 EHA105 菌液生长的影响
3.3.4 Kan对人参愈伤组织生长的影响
3.3.5 农杆菌侵染愈伤组织
3.3.6 共培养后材料脱菌培养
3.3.7 阳性材料初步筛选
3.4 结果与分析
3.4.1 不同浓度Cef对人参愈伤组织生长的影响
3.4.2 Cef对 EHA105 菌液生长的影响
3.4.3 愈伤组织侵染及脱菌培养
3.4.4 Kan对人参愈伤组织生长的影响
3.4.5 阳性材料初步筛选及检测
3.5 讨论
第四章 三七原生质体制备
4.1 试验材料
4.2 试验仪器试剂
4.2.1 主要试验仪器
4.2.2 主要试剂
4.3 试验方法
4.3.1 三七原生质体分离纯化
4.3.2 原生质体产量计算及活力检测
4.3.3 不同培养天数对原生质体产量和活力影响
4.3.4 不同离心力对原生质体产量和完整度的影响
4.3.5 不同渗透压对原生质体分离的影响
4.3.6 不同酶解时间对原生质体分离的影响
4.3.7 不同酶液配比对原生质体分离的影响
4.4 结果与分析
4.4.1 不同培养天数对原生质体产量和活力影响
4.4.2 不同离心力对原生质体产量和完整度的影响
4.4.3 不同渗透压对原生质体分离的影响
4.4.4 不同酶解时间对原生质体分离的影响
4.4.5 不同酶液配比对原生质体分离的影响
4.5 讨论
第五章 结论
参考文献
附录A
附录B
附录C
附录D
致谢
作者简历
本文编号：3897194
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 基因编辑技术发展历程
1.1.1 ZFN技术简介
1.1.2 TALENs技术简介
1.1.3 归巢核酸酶技术简介
1.1.4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
1.2 CRISPR/Cas9 作用原理及应用
1.2.1 CRISPR/Cas9 作用原理
1.2.2 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术应用
1.3 人参皂苷生物合成路径及目的基因功能
1.3.1 人参皂苷生物合成路径
1.3.2 环阿乔醇合酶基因
1.3.3 达玛烯二醇合酶基因
1.4 研究内容及目的意义
1.4.1 研究内容
1.4.2 研究目的及意义
第二章 CRISPR/Cas9 载体构建及转化
2.1 试验材料
2.2 试验仪器试剂
2.2.1 主要试验仪器
2.2.2 主要试验试剂
2.3 试验方法
2.3.1 sgRNA设计
2.3.2 Oligo二聚体合成连接
2.3.3 质粒转化及保存
2.3.4 质粒提取
2.3.5 质粒转导EHA105农杆菌
2.4 结果与分析
2.4.1 载体构建
2.4.2 质粒转化农杆菌
2.5 讨论
第三章 农杆菌介导的人参愈伤组织转化
3.1 试验材料
3.2 试验仪器试剂
3.2.1 主要试验仪器
3.2.2 主要试剂
3.3 试验方法
3.3.1 愈伤组织继代培养
3.3.2 Cef对人参愈伤组织生长的影响
3.3.3 Cef对 EHA105 菌液生长的影响
3.3.4 Kan对人参愈伤组织生长的影响
3.3.5 农杆菌侵染愈伤组织
3.3.6 共培养后材料脱菌培养
3.3.7 阳性材料初步筛选
3.4 结果与分析
3.4.1 不同浓度Cef对人参愈伤组织生长的影响
3.4.2 Cef对 EHA105 菌液生长的影响
3.4.3 愈伤组织侵染及脱菌培养
3.4.4 Kan对人参愈伤组织生长的影响
3.4.5 阳性材料初步筛选及检测
3.5 讨论
第四章 三七原生质体制备
4.1 试验材料
4.2 试验仪器试剂
4.2.1 主要试验仪器
4.2.2 主要试剂
4.3 试验方法
4.3.1 三七原生质体分离纯化
4.3.2 原生质体产量计算及活力检测
4.3.3 不同培养天数对原生质体产量和活力影响
4.3.4 不同离心力对原生质体产量和完整度的影响
4.3.5 不同渗透压对原生质体分离的影响
4.3.6 不同酶解时间对原生质体分离的影响
4.3.7 不同酶液配比对原生质体分离的影响
4.4 结果与分析
4.4.1 不同培养天数对原生质体产量和活力影响
4.4.2 不同离心力对原生质体产量和完整度的影响
4.4.3 不同渗透压对原生质体分离的影响
4.4.4 不同酶解时间对原生质体分离的影响
4.4.5 不同酶液配比对原生质体分离的影响
4.5 讨论
第五章 结论
参考文献
附录A
附录B
附录C
附录D
致谢
作者简历
本文编号：3897194
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3897194.html