CRISPR/Cas9介导β4GalNT2和ZBED6基因敲除猪制备

发布时间：2024-02-20 23:14

　　一、β1,4 N-乙酰半乳糖胺转移酶(β1,4 N-acetylgalactosaminyl transferase,β4Gal NT2)基因敲除猪的制备猪β4Gal NT2及其产物是引起异种移植排斥反应的重要非Gal抗原之一。为了进一步降低异种移植排斥反应,本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的巴马小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)技术制备β4Gal NT2基因敲除猪。设计靶向猪β4Gal NT2基因的单链导向RNA(Single guide RNA,sg RNA),构建sg RNA表达载体,将其电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,进行单细胞培养。采用PCR、TA克隆及测序的方法鉴定单细胞克隆的突变类型。选择β4Gal NT2基因突变的单细胞克隆为核供体,通过体细胞核移植技术制备β4Gal NT2基因敲除猪。利用上述鉴定单细胞克隆突变类型的...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
SUMMARY
英文缩略
第一部分 文献综述
    1 猪 Β4GALNT2与异种器官移植
        1.1 异种器官移植
        1.2 猪 β4GalNT2基因
    2 ZBED6与肌肉生长
        2.1 ZBED6的发现
        2.2 ZBED6的研究进展
    3 CRISPR/CAS9的发现及发展
    4 本研究的目的和意义
第二部分 CRISPR/CAS9介导的 Β4GALNT2基因敲除猪制备
    1 实验材料
        1.1 动物性材料
        1.2 主要试剂及实验耗材
        1.3 主要仪器设备
        1.4 溶液的配制
    2 实验方法
        2.1 CRISPR/Cas9靶向载体的设计及构建
        2.2 sgRNA表达载体基因突变效率检测
            2.2.1 细胞的转染
            2.2.2 PCR、TA克隆及测序
        2.3 单细胞克隆的获得及鉴定
        2.4 β4GalNT2基因敲除猪的制备及鉴定
        2.5 PBMC与FITC-DBA共孵育
        2.6 脱靶分析
    3 结果与分析
        3.1 CRISPR/Cas9靶向载体的构建及基因突变效率
        3.2 单细胞克隆鉴定
        3.3 β4GalNT2基因敲除猪的制备及鉴定
        3.4 PBMC与FITC-DBA共孵育
        3.5 脱靶分析
    4 讨论
第三部分 CRISPR/CAS9介导的ZBED6基因敲除猪制备
    1 实验材料
        1.1 动物性材料
        1.2 主要试剂及实验耗材
        1.3 主要仪器设备
        1.4 溶液的配制
    2 实验方法
        2.1 CRISPR/Cas9靶向载体的设计及构建
        2.2 sgRNA表达载体基因突变效率检测
        2.3 单细胞克隆的获得及鉴定
        2.4 ZBED6基因敲除猪的制备及鉴定
        2.5 脱靶分析
        2.6 ZBED6基因敲除猪与野生型猪的比较
    3 结果与分析
        3.1 CRISPR/Cas9靶向载体的构建及基因突变效率
        3.2 单细胞克隆鉴定
        3.3 ZBED6基因敲除猪的制备及鉴定
        3.4 脱靶分析
        3.5 ZBED6基因敲除猪与野生型猪的比较
            3.5.1 外观与体重比较
            3.5.2 生理指标检测
            3.5.3 胰岛素和IGF2检测
            3.5.4 凝血四项检测
    4 讨论
第四部分 结论
参考文献
致谢
作者简介
导师简介



本文编号：3904667