基于CRISPR/CAS9技术的EML4-ALK融合基因检测参考物质研究

发布时间：2024-02-22 10:37

　　肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是全球癌症相关致死的主要原因之一。在检出的肺癌患者中,有80%-85%为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC),且其中大部分病例在确诊时已是中晚期,五年生存率仅为10%-15%。NSCLC的传统治疗包括手术、化疗和放疗等手段,但随着近年来研究者对NSCLC研究的不断深入以及精准医疗的发展,依据患者的遗传信息以制定个体化治疗方案在NSCLC治疗中的作用日益凸显。目前,已有一系列NSCLC靶向治疗相关的基因突变和基因重排分子检测在临床上得以广泛应用。其中人类棘皮动物微管相关蛋白样 4(Echinoderm microtubule-associated protein like 4,EML4 基因和人类间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因重排形成的融合基因,即EML4-ALK融合基因检测即被证明可用于指导NSCLC患者进行克唑替尼靶向治疗。目前,EML4-ALK融合基因的常用检测方法有免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、荧光原位杂交(Fl...

【文章页数】：184 页

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前言
1. 材料和方法
    1.1 实验材料和试剂配制
        1.1.1 实验仪器
        1.1.2 实验耗材
        1.1.3 实验试剂
        1.1.4 溶液配制
        1.1.5 细胞系
        1.1.6 菌株及载体
        1.1.7 实验动物
    1.2 实验方法
        1.2.1 HEK293T细胞系及各非小细胞肺癌细胞系的培养
            1.2.1.1 细胞复苏
            1.2.1.2 细胞换液
            1.2.1.3 细胞计数及传代
            1.2.1.4 细胞冻存
        1.2.2 HEK293T细胞系EML4-ALK融合基因状态验证
            1.2.2.1 HEK293T、H3122及H2228细胞总RNA提取
            1.2.2.2 RT-qPCR方法验证HEK293T细胞EML4-ALK融合基因状态
        1.2.3 CRISPR/Cas9技术构建EML4-ALK融合基因阳性细胞系
            1.2.3.1 靶位点选择及sgRNA设计
            1.2.3.2 CRISPR/Cas9表达载体的构建及鉴定
            1.2.3.3 携带不同sgRNA的CRISPR/Cas9表达载体筛选
            1.2.3.4 EML4-ALK融合基因阳性混合克隆制备及验证
            1.2.3.5 EML4-ALK融合基因阳性单克隆细胞筛选
        1.2.4 基于CRISPR/Cas9技术构建的EML4-ALK融合基因阳性细胞系验证
            1.2.4.1 DNA水平验证
            1.2.4.2 RNA水平验证
            1.2.4.3 蛋白水平验证
        1.2.5 携带相关EML4-ALK融合基因的异种移植动物模型建立
            1.2.5.1 实验动物的准备
            1.2.5.2 接种细胞悬液制备
            1.2.5.3 动物接种
            1.2.5.4 异种移植成瘤观察及动物处死
        1.2.6 新型EML4-ALK融合基因参考物质制备及验证
            1.2.6.1 新型EML4-ALK融合基因参考物质制备
            1.2.6.2 新型EML4-ALK融合基因参考物质IHC方法验证
            1.2.6.3 新型EML4-ALK融合基因参考物质FISH方法验证
            1.2.6.4 新型EML4-ALK融合基因参考物质RT-qPCR方法验证
            1.2.6.5 新型EML4-ALK融合基因参考物质NGS方法验证
        1.2.7 新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性及稳定性探究
            1.2.7.1 新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性研究
            1.2.7.2 新型EML4-ALK融合基因参考物质稳定性研究
2. 结果
    2.1 HEK293T细胞系及各非小细胞肺癌细胞系的培养及EML4-ALK融合基因状态验证
        2.1.1 HEK293T细胞系及各非小细胞肺癌细胞系的培养
        2.1.2 HEK293T细胞系EML4-ALK融合基因状态验证
    2.2 CRISPR/CAS9技术构建EML4-ALK融合基因阳性细胞系
        2.2.1 EML4-ALK融合基因靶向sgRNA设计
        2.2.2 pX330载体验证
        2.2.3 pX330-sgRNA重组质粒载体验证
        2.2.4 pX330-sgRNA重组质粒载体筛选
        2.2.5 混合克隆制备及验证
        2.2.6 单克隆细胞筛选
    2.3 新型EML4-ALK融合基因阳性细胞系验证
        2.3.1 DNA水平验证
        2.3.2 RNA水平验证
        2.3.3 蛋白质水平验证
    2.4 异种移植动物模型建立
    2.5 新型EML4-ALK融合基因参考物质制备及验证
        2.5.1 新型EML4-ALK融合基因参考物质制备
        2.5.2 新型EML4-ALK融合基因参考物质IHC方法验证
        2.5.3 新型EML4-ALK融合基因参考物质FISH方法验证
        2.5.4 新型EML4-ALK融合基因参考物质RT-qPCR方法验证
        2.5.5 新型EML4-ALK融合基因参考物质NGS方法验证
    2.6 新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性及稳定性探究
        2.6.1 新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性验证
        2.6.2 新型EML4-ALK融合基因参考物质稳定性验证
3. 讨论
参考文献
论文综述
    References
附录
    附录1 PX330载体信息
        1. pX330载体结构
        2. pX330载体位点
        3. pX330载体序列
    附录2 PEGFP-1载体信息
        1. pEGFP-1载体结构
        2. pEGFP-1载体位点
        3. pEGFP-1载体序列
    附录3 PMD18-T载体信息
        1. pMD18-T载体结构
        2. pMD18-T载体位点
        3. pMD18-T载体序列
    附录4 EML4-ALK融合基因V1型、V2型及V3型MRNA序列信息
        1. EML4-ALK融合基因V1型mRNA序列信息
        2. EML4-ALK融合基因V2型mRNA序列信息
        3. EML4-ALK融合基因V3a型mRNA序列信息
        4. EML4-ALK融合基因V3b型mRNA序列信息
    附录5 EML4基因及ALK基因MRNA序列信息
        1. EML4基因mRNA序列信息
        2. ALK基因mRNA序列信息
    附录6 EML4基因INTRON 13/INTRON 20/INTRON 6及ALK基因INTRON 19序列信息
        1. EML4基因intron 13序列信息
        2. EML4基因intron 20序列信息
        3. EML4基因intron 6序列信息
        4. ALK基因intron 19序列信息
致谢
个人简介



本文编号：3906655