人类N-RAS等位基因特异性Taqman Q-PCR的初步研究

发布时间：2024-03-11 03:17

　　西妥昔单抗和帕尼单抗是表皮生长因子受体抑制剂,此类靶向治疗药物的出现,有效抑制了结直肠癌的发生发展,但西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗受到EGFR下游RAS基因的影响,RAS突变型能自动活化通路并转导下游信号,所以只有RAS野生型患者才能对EGFR单抗的治疗产生良好效果。RAS突变中N-RAS突变仅占约2%,不容易受到研究重视,因此本文对N-RAS的突变检测进行研究。本文先通过N-RAS常见的17种突变位点,构建了N-RAS突变型和野生型的质粒,提取质粒后通过电泳观察条带颜色,颜色较亮,用nanodrop检测质粒浓度结果为40ng/μL。测序验证显示模板DNA序列与合成序列一致。采用Taqman探针荧光定量PCR技术,使用Primer Express 3.0软件设计野生型和突变型引物及探针,经过PCR反应体系优化后得出最佳反应体系的条件,引物终浓度为0.4μΜ/μL,探针终浓度为0.2μΜ/μL,模板DNA终浓度为1ng/μL,并以此建立单引物荧光定量PCR反应体系。单引物体系构建完成后分别用单引物验证其特异性,2号外显子12号密码子野生型模板荧光定量PCR的Ct值分别为:20.5456,2...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1.1第一代基因测序原理

图1.1第一代基因测序原理先由dNTP（短寡聚核苷酸）自身反应之。之后用终止试剂（不含聚合酶的双脱氧同大小的分子最终筛选分离。DNA模板后在DNA聚合酶作用下生成一部分均由一种ddNTP将其终止，后用所需序列读出。

图1.2延伸反应分组示意图

图1.1第一代基因测序原理由图1.1可知，首先由dNTP（短寡聚核苷酸）自身反应之后被用作引物来导新DNA链的合成[5]。之后用终止试剂（不含聚合酶的双脱氧核苷酸）对引物伸出大量不同形状、不同大小的分子最终筛选分离。测序引物结合单链DNA模板后在DNA聚合酶....

图1.3illumina测序原理

图1.3illumina测序原理DNA待测文库构建出单链的DNA文库前要将待测样本DNA打断成多个长度为200-，在这些小片段的两端加上不同接头。Flowcellcell以槽道的形式吸附流动的DNA片段，建立文库后，DNA片段在随机附着在其表面。每个F....

图1.4Solid测序原理

齐鲁工业大学硕士学位论文行下一轮测序反应。这种测序技术每次只用添加一个dNTP的特点就可以很高同聚物长度的测量精度，此技术的主要测序误差来自于碱基的替换%-1.5%之间[16]。ABI公司于2007年开始投入Solid测序技术[17]并开发此技术机器进行商应用。So....

本文编号：3925740