重组载脂蛋白AI突变体的表达及抗炎作用的实验研究
发布时间：2020-10-17 22:06
动脉粥样硬化(As)是一种发生在大、中动脉的慢性炎症性疾病。载脂蛋白A-I(apoA-I)的天然半胱氨酸突变体apoA-IMilano(A-IM)和apoA-IParis均表现出增强的心血管保护活性,二聚体是其主要的活性形式。根据apoA-I的结构特点和上述突变体发生突变的特殊位置,本课题组自行设计并构建了7个apoA-I的半胱氨酸突变体。我们前期实验所诱变的半胱氨酸突变体在体外也可以不同程度的形成二聚体,本实验选用其中极易形成二聚体的A-I(S228C)突变体进行初步研究。 [目的] 原核表达并纯化重组蛋白A-I(S228C)、A-IM和野生型AI(WT-AI)。以内毒素血症大鼠为炎症模型,通过与WT-AI和AIM比较,重点观察A-I(S228C)突变体的抗炎和抗氧化作用,探讨对炎症和多器官功能损害的保护作用及机制,以期为其抗As提供实验依据,并为我们深入理解apoA1结构与功能的关系奠定基础。 [方法] 利用pET原核表达系统表达重组蛋白A-I(S228C)、A-IM和WT-AI,Ni2+亲和柱进行目的蛋白纯化,经TritonX-114和Pierce亲和柱去除内毒素,鲎试剂法检测内毒素合格后与大豆卵磷脂包装形成脂质体。采用阴茎背静脉注射内毒素复制内毒素血症大鼠模型;30只雄性Wister大鼠随机分为六组:盐水对照组(生理盐水+生理盐水,n=4)、模型组(生理盐水+内毒素,n=4)、磷脂对照组(大豆卵磷脂+内毒素,n=4)、WT-AI组(WT-AI+内毒素,n=6)、A-IM组(A-IM+内毒素,n=6)和A-I(S228C)突变体组(A-I(S228C)+内毒素,n=6)。各组动物实验前及内毒素注射后6小时,剪尾取血,分离血清,采用酶法测定血清脂质含量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清炎症因子TNF-α、IL-1β, IL-6和粘附分子ICAM-1的含量,试剂盒检测血清ALT、AST、Urea、Cre和CK等反映肝肾肌组织功能指标的含量,MDA、NO和T-AOC试剂盒测定血清脂质过氧化程度及总抗氧化能力。将大鼠固定,PBS灌流,取心、肝、脾、肺、肾组织置于10%中性福尔马林中固定,石蜡包埋,连续切片,HE染色,光镜观察组织病理结构改变、白细胞浸润等。 [结果] 重组蛋白A-I(S228C)、A-IM和WT-AI表达量超过10mg/L菌液,经Ni2+亲和柱纯化及TritonX-114和Pierce亲和柱去除内毒素后,纯度达到90%,内毒素含量达到注射标准。内毒素血症模型大鼠出现炎症表型。A-I(S228C)突变体组与模型组相比,大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和粘附分子ICAM-1含量(P0.01)以及血清ALT、AST、Urea、Cre和CK水平显著降低(均为P0.05);血清MDA和NO含量显著降低(分别为:P0.01和P0.05);机体总抗氧化能力显著增加(P0.01);光镜观察肺组织病理结构改变和白细胞浸润得到明显改善。 [结论] 1、获得大量高纯度的WT-AI及A-IM、A-I(S228C)突变体蛋白。 2、成功复制内毒素血症大鼠模型。 3、重组蛋白A-I(S228C)能降低大鼠血清炎症因子及粘附分子水平。 4、重组蛋白A-I(S228C)能增强大鼠机体的总抗氧化能力,并抑制血清脂质过氧化。 5、重组蛋白A-I(S228C)能降低大鼠血清肝、肾、肌功能指标含量,改善肺组织病理结构改变及白细胞浸润,提示对大鼠肝脏、肾脏、肺脏、骨骼肌和心肌等多种组织器官具有保护作用,其保护作用机制可能与其抗炎和抗氧化作用有关。 6、重组蛋白A-I(S228C)的抗炎、抗氧化及对多器官功能损害的保护作用与 A-IM比较未见明显差异,是否同样具有抗As作用有待于进一步探讨。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R543
【部分图文】：
第一部分 重组蛋白的原核表达、纯化，内毒素的去及脂质体包装一、重组蛋白的原核表达及纯化分别利用科室保存的 WT-AI 及 A-IM、A-I(S228C)两种半胱氨酸pET-30b(+)重组表达质粒转化 BL21(DE3)宿主表达菌，1mM IPTG 诱导表达小时后，超声破碎菌体，分离上清和沉淀，经 12% SDS－PAGE 电泳，考马斯色，可见重组质粒转化 BL21(DE3)菌体裂解液中明显表达的目的蛋白带，分预期相同，为 29kD；超声破菌结果显示，apoA-I 等蛋白主要以可溶性形式上清中(图 1)。因所有目的蛋白 C-末端都带有组氨酸 6 聚体标签，可经 Ni2+亲和柱纯化纯化后经 12% SDS－PAGE(还原型)电泳鉴定纯度>90%(图 1，图 2)。纯化蛋白约为 10-12mg/L 菌液，与前期实验结果相一致[23](图 1，2)。
为了观察我们所表达的 WT-AI、AIM和 AI-228 三种蛋白二硫键形成情用氧化型和还原型 SDS-PAGE 两种电泳对其进行检测（图 2）：所有蛋白白定量后，取相同蛋白量上样，经过相同的处理，所不同的是部分加入还原型 SDS-PAGE，部分未加 DTT，进行氧化型 SDS-PAGE。电泳结果显示在溶液中仍以单体形式存在；apoA-I 半胱氨酸突变体 A-I(S228C)，单通过二硫键形成二聚体，从而使得该蛋白在溶液中主要以二聚体形式存入 DTT 还原后仍有部分蛋白以二聚体形式存在，而 A-IM二聚体的I(S228C)突变体相对减少，加入 DTT 使二聚体完全还原为单体。
大鼠肺脏病理结构改变的比较（10×10）
【参考文献】
本文编号：2845365
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R543
【部分图文】：
第一部分 重组蛋白的原核表达、纯化，内毒素的去及脂质体包装一、重组蛋白的原核表达及纯化分别利用科室保存的 WT-AI 及 A-IM、A-I(S228C)两种半胱氨酸pET-30b(+)重组表达质粒转化 BL21(DE3)宿主表达菌，1mM IPTG 诱导表达小时后，超声破碎菌体，分离上清和沉淀，经 12% SDS－PAGE 电泳，考马斯色，可见重组质粒转化 BL21(DE3)菌体裂解液中明显表达的目的蛋白带，分预期相同，为 29kD；超声破菌结果显示，apoA-I 等蛋白主要以可溶性形式上清中(图 1)。因所有目的蛋白 C-末端都带有组氨酸 6 聚体标签，可经 Ni2+亲和柱纯化纯化后经 12% SDS－PAGE(还原型)电泳鉴定纯度>90%(图 1，图 2)。纯化蛋白约为 10-12mg/L 菌液，与前期实验结果相一致[23](图 1，2)。
为了观察我们所表达的 WT-AI、AIM和 AI-228 三种蛋白二硫键形成情用氧化型和还原型 SDS-PAGE 两种电泳对其进行检测（图 2）：所有蛋白白定量后，取相同蛋白量上样，经过相同的处理，所不同的是部分加入还原型 SDS-PAGE，部分未加 DTT，进行氧化型 SDS-PAGE。电泳结果显示在溶液中仍以单体形式存在；apoA-I 半胱氨酸突变体 A-I(S228C)，单通过二硫键形成二聚体，从而使得该蛋白在溶液中主要以二聚体形式存入 DTT 还原后仍有部分蛋白以二聚体形式存在，而 A-IM二聚体的I(S228C)突变体相对减少，加入 DTT 使二聚体完全还原为单体。
大鼠肺脏病理结构改变的比较（10×10）
【参考文献】
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3 孙同柱,付小兵,姚咏明,杨银辉,陈伟,赵志力,孙晓庆;一种较好的雄性大鼠静脉给药途径[J];实验动物科学与管理;2002年01期
本文编号：2845365
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