奶牛隐性乳房炎中致病性大肠杆菌luxS及pfs基因表达及AI-2体外合成

发布时间：2020-11-03 08:40

　　 为了了解luxS基因和pfs基因变异情况,探索信号分子AI-2(Autoinducer-2,AI-2)体外合成的影响因素。本试验应用PCR法扩增了奶牛隐性乳房炎致病性大肠杆菌E285的luxS和pfs基因,经酶切后插入原核表达载体pET-30a(+)中,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定及分析,构建luxS和pfs基因的重组表达质粒pET-luxS和pET-pfs,经诱导、纯化获得可溶性重组LuxS蛋白和Pfs蛋白,利用纯化的重组蛋白LuxS和Pfs体外合成AI-2分子。结果表明,扩增获得的luxS基因和pfs基因高度保守,与GenBank中已发表的核苷酸序列同源性均达到98%以上;两基因在原核表达系统中均获得了高效表达,利用获得重组蛋白LuxS和Pfs体外催化SAH,获得了AI-2分子,其浓度为200μmol/L,对其活性检测显示为阴性对照DH5α的61倍。提示奶牛隐性乳房炎致病性大肠杆菌E285的LuxS和Pfs蛋白在体外能催化SAH产生高活性的AI-2。为深入研究AI-2对E285的毒力基因表达、生物被膜形成的调控奠定基础。
【部分图文】：

以特异性引物进行扩增luxS基因和pfs基因,结果显示,扩增到的条带分别约为516 bp和690 bp,与目的条带大小一致(图1)。表明PCR扩增到了目的片段。2.2 重组质粒的鉴定

构建的重组质粒经PCR鉴定结果显示,2个重组质粒均能扩增到和目的片段大小相同的片段(图2A)。重组质粒pET-luxS分别用EcoR I、Hind III单酶切,均获得了1条约5 938 bp条带,与重组质粒大小一致;用EcoR I和Hind III双酶切得到1条约5 422 bp和1条516 bp两条带,小带与目的基因luxS基因大小相同;pET-pfs分别用EcoR I、Hind III单酶切,均获得了一条约6 112 bp条带,与重组质粒大小一致,用EcoR I和Hind III双酶切得到1条约5 422 bp和1条690 bp两条带,小带与目的基因pfs基因大小相同(图2B、C)。PCR和酶切鉴定均证明重组质粒pET-luxS和pET-pfs构建成功。2.2.2 luxS基因和pfs基因序列测定

将表达纯化的LuxS和Pfs蛋白免疫新西兰大白兔获得的多抗,通过Western Blot鉴定后,在相应的位置出现了条带(24 ku和30 ku)(图4),与预期结果相符。图4 重组蛋白LuxS和Pfs Western Blot 检测及其纯化产物的SDS-PAGE
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本文编号：2868347