基于等位基因特异性DNA酶自组装SNPs分型新方法

发布时间：2024-04-23 02:57

　　药物代谢相关基因SNPs的简单、快速分型对指导相关药物的个体化使用具有重要意义。本课题设计了一种等位基因特异性DNA酶自组装(Allele specific DNAzyme assembly,ASDA)比色新方法,用于SNPs简单、快速分型。该方法可直接使用口腔拭子样本,免DNA提取和纯化进行SNPs基因分型检测。本文以MTHFR C677T等位基因为模板设计了新的等位基因特异性引物,同时标记含有G4-DNA酶的茎环结构,从而将特异性的PCR扩增子转化为多个G4-DNA酶组装物。通过引入额外错配位点并进行优化以减少非特异性扩增。基于等位基因特异性DNA酶自主装策略,该方法能从低至200个细胞样本中直接鉴定MTHFR C677T等位基因型,显示了较高的灵敏度和优异的选择性。可在90分钟内直接检测出口腔咽拭子样本的基因型,具有良好的准确性、稳定性和实用性。本文建立的等位基因特异性DNA酶自组装比色新方法为临床实验室提供了一个实用的平台用于简单、快速SNPs基因分型,并且为发展中国家促进个体化用药的广泛应用提供潜在的检测工具。

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1等位基因特异性DNA酶自组装SNPs分型新方法实验原理

3结果和讨论3.1方法原理及设计策略基于等位基因特异性DNA酶自组装SNPs分型新方法的实验原理如图1所示，DNA释放、DNA扩增、SNPs识别和信号输出都在一个PCR管中完成。口腔拭子中的上皮细胞基因组DNA在变性阶段释放并直接由KODFXDNA聚合酶扩增[1....

图2琼脂糖凝胶电泳表征图：（A）AS引物3’末端倒数第3个碱基引入不同错配的特异性验证，（B）50ng基因组DNA，2μL全血，1.4×104白细胞及口腔细胞的AS-PCR产物

重庆医科大学硕士研究生学位论文，反之亦然[36]。临床实际样本中含有许多抑制剂，如血红蛋白、IgG、乳铁都可显著降低大多数DNA聚合酶的活性。因此，对未经样本直接进行PCR扩增时必须选择能够抵抗这些抑制剂已知型别的MTHFR677等位基因实际样本验证了KODF性....

图3G4-AS引物在退火温度为68°C时扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图

MTHFR677等位基因型进行准确增子与Hemin结合催化ABTS2-/，WP反应管中野生型（677CC）而MP反应管在该处几乎没有吸收MP反应管中出现明显的吸收峰（图管在418nm处都出现明显的吸收峰的比色方法可以准确地对口腔拭子的插图为相应的比色结果，....

图4（A）G4-AS引物用于直接扩增口腔拭子上皮细胞的琼脂糖凝胶电泳图；基于ASDA的比色分析方法的UV-vis吸收光谱和可视化照片（插图）：（B）野生型模板；（C）杂合突变型

AS引物用于直接扩增口腔拭子上皮细胞的琼脂糖凝胶电泳图；基UV-vis吸收光谱和可视化照片（插图）：（B）野生型模板；（C）突变型模板；该实验的标本为口腔拭子，WP反应管为（a）和M（b）。（E）MTHFR677三种型别的SangerDNA测序结果hegel....

本文编号：3962512