家蚕BmBR-C Z2调控免疫机制的初探

发布时间：2020-04-03 04:47

【摘要】：BR-C基因是蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20E)下游重要的转录应答因子之一。在果蝇、家蚕等不同昆虫的研究中发现,BR-C蛋白都有一个高度保守的蛋白-蛋白相互作用核心结构域BTB,通过融合不同的C2H2锌指结构域产生多种蛋白异构体亚型。由于在不同昆虫中BR-C基因的结构相对保守性,其功能也具有一定的相似性。昆虫的生长发育受到蜕皮激素和保幼激素的调控,BR-C基因在这些调控过程中扮演着重要的角色。近年来越来越多的研究发现20E也参与了昆虫的免疫调节,在黑腹果蝇中进一步的研究中发现BR-C基因也参与了20E诱导的免疫反应。研究显示BR-C基因可以在20E的诱导下通过激活抗菌肽基因的表达来提高果蝇的抗菌能力,此外,BR-C基因还可以激活Relish基因的表达并且与其有活性的蛋白片段结合共同调节抗菌肽基因的表达。然而该基因在家蚕中是否也具有同样重要的作用还鲜有报道。本文的实验对象家蚕不仅可以作为一种模式生物,更是蚕丝生产中提供重要经济价值的昆虫,但是蚕体细菌的感染对这一农业生产造成了一定的困扰,因此研究家蚕的免疫调节机制至关重要。已有研究证明20E除了调控家蚕的变态发育,也参与了蚕体中肠、血液、脂肪体等免疫器官的免疫调节机制。BmBR-C Z2作为重要的蜕皮激素应答因子,由于该基因的保守性,可能也具有免疫调节的功能。为此,我们对BmBR-C Z2在免疫调节中的功能进行了探究后得到如下结论:1、家蚕BmBR-C Z2基因表达分析通过蚕体解剖得到家蚕5龄3天各组织及血液各时期的实验材料,各组织通过液氮冷冻研磨后提取RNA,血细胞-20℃离心后直接进行RNA提取,反转录得到cDNA模板。首先,通过荧光定量PCR技术分析各组织材料中BmBR-C Z2基因的表达情况,结果显示该基因在蚕体5龄3天各组织中广泛表达。检测结果显示该基因在家蚕4龄眠期的血液中表达量会达到一个峰值,随后表达量下降,在预蛹期的表达量又显著地上升。这一现象可能与蚕体各个时期体内蜕皮激素的水平不一致相关。2、家蚕BmBR-C Z2基因与20E可调控免疫相关基因的表达在蚕体和细胞中分别添加20E后,提取细胞及蚕体血细胞的RNA,反转录得到cDNA模板。荧光定量PCR检测BmBR-C Z2基因的表达量后发现20E会上调该基因的表达。此外,我们检测了细胞中添加20E后抗菌类基因的表达情况,结果显示部分基因的表达量被显著地上调,其中包括溶菌酶LZM及抗菌肽LEB、GLO、CECB、CECD等。为了验证BmBR-C Z2基因是否也能调控相关抗菌肽的表达,我们扩增得到BmBR-C Z2的cDNA全长,将其连接在pSL1180-A4-Dsred过表达载体上,提取重组质粒后在细胞中进行转染对该基因进行了瞬时过表达。过表达成功后通过定量PCR检测了细胞中抗菌类基因的表达情况,结果显示BmBR-C Z2能够显著上调溶菌酶LZM及抗菌肽LEB、GLO、ATT1等表达。由此推测BmBR-C Z2同20E类似,可以诱导部分抗菌类基因的表达。3、家蚕BmBR-C Z2基因可影响家蚕的抗菌能力由于过表达BmBR-C Z2基因会影响抗菌类基因的表达情况,那么BmBR-C Z2基因如何参与细菌攻毒后蚕体的免疫应答机制需要进一步深入探索。本实验首先选取5龄3天的健康蚕体进行细菌注射攻毒实验,收集注射后不同时间段的血细胞,得到cDNA模板后进行荧光定量PCR分析。结果显示,在攻毒30min后,BmBR-C Z2基因的表达量明显上调。为了进一步验证BmBR-C Z2是否参与了家蚕抵御细菌侵袭的免疫调控反应,我们设计了该基因特异性片段的引物并合成了ds BmBR-C Z2双链干涉片段。在SID-1细胞系中添加dsBmBR-C Z2后可以检测到抗菌类基因的表达量明显下调,包括溶菌酶LZM及LEB、GLO、CECB1等抗菌肽。随后,我们给5龄2天的蚕体注射了双链干涉片段ds BmBR-C Z2,紧接着对蚕体进行了细菌注射。与对照组相比,实验组蚕体的存活率远远下降。由此推测,细菌感染对蚕体中BmBR-C Z2基因的表达量有影响,借此来上调蚕体中部分抗菌肽基因的表达提高自身的抗菌灭菌能力。相反,在蚕体中下调BmBR-C Z2会下调抗菌类基因的表达,使得蚕体抵抗细菌的能力大大降低。4、家蚕BmBR-C Z2基因可以结合在LZM基因的启动子上激活其表达选取上述实验中抗菌类基因表达量变化最显著的LZM(溶菌酶)基因,在家蚕的基因数据库中下载得到该基因启动子预测序列,通过PCR扩增技术得到启动子序列产物,将其连接在双荧光素酶酶活报告系统的质粒PGL-3上,将这一重组质粒与BmBR-C Z2过表达质粒在BmE细胞系中进行共转染。瞬转48h之后通过测定启动子区域双荧光素酶酶活的活性,确定BmBR-C Z2基因对被检测基因启动子的调控能力及区域。结果显示与对照组相比,实验组双荧光素酶重组质粒的酶活性明显较高。将启动子全长进行截短,将前后两部分再次PCR扩增后连于载体上再次检测,结果显示BmBR-C Z2可以结合在LZM启动子序列-1476至+88的位置来调控LZM基因的表达,从而参与到家蚕免疫调控中并且提高了家蚕对细菌的抵御能力。
【图文】：

反应机制,天然免疫

的天然免疫由体液免疫和细胞免疫组成，他们协同作用吞噬和源入侵物。当病原体相关的分子模式结合宿主的模式识别受体的外来生物就会被免疫系统识别。反过来，这又会激活免疫信级联反应放大免疫反应，，诱导产生具有抵抗微生物活性的抗菌应器途径[1]。昆虫的体液免疫应答是多种类型的生物活性短肽肽，抗菌肽，类细胞因子等；在鳞翅目、双翅目、鞘翅目等 8超过 200 多种昆虫抗菌肽类物质，仅从家蚕这一种昆虫获得了细胞免疫应答包含吞噬，结节，包囊和黑化反应等。吞噬是通结节是血细胞粘附、聚集在外来物表面，而包囊针对体积更大血细胞在昆虫的天然免疫中起着重要的作用。昆虫的免疫信号 Toll，Imd，Jak / Stat，JNK 和胰岛素途径。这些途径的激活共病原体造成杀伤作用，并且在上述某些过程中，激素也参与了制[2-6]。

蜕皮激素,家蚕,体液,中肠

1.2 20E 通过激活并增强 PGRP-SA 来调控东亚飞蝗的免疫反应[25].2. Model for 20E activated and enhanced PGRP-SAmediated immune respin Locusta migratoria.素20E对家蚕免疫反应的调节对于家蚕的生长发育也起到了很重要的调控作用，但是激素调相关研究还比较少，主要集中在以下几个方面。在家蚕中肠组中发现，在中肠中可以检测到多类免疫相关基因的表达量在预体中注射 20E 可以得到同样的结果[26]。此外，当家蚕血液中的时，20E 的细胞内受体 EcR 和 USP 基因的表达量也被大幅度众多免疫相关基因的表达量明显升高。这一结果说明血淋巴中加能够刺激多种抗菌蛋白或多肽的产生[27]。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S884

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