芝麻品种茎点枯病抗性鉴定及SiPYL4、SiTLP基因的功能分析

发布时间：2020-11-21 13:12

　　芝麻茎点枯病是由菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)引起的真菌性土传病害,对芝麻的产量和质量造成了严重威胁。因此,挖掘抗病基因,选育和种植抗病品种,对保证芝麻高产稳产具有十分重要的意义。本研究用不同地区的44个芝麻品种进行田间芝麻茎点枯病的抗性鉴定。借助转录组测序结果挑选出两个抗芝麻茎点枯病相关基因SiPYL4、SiTLP,对SiPYL4、SiTLP进行了克隆,利用Gateway技术构建了植物过表达载体,对拟南芥进行遗传转化,并对转基因植株进行了抗病性鉴定,主要得到以下结果:1、对不同地区的44个芝麻品种进行了田间芝麻对茎点枯病的抗性鉴定,鉴定结果表明,没有高抗和免疫品种,中抗(MR)芝麻种质资源为26份,占供试种质的59.1%;中感(MS)芝麻种质资源共14份,占供试种质的31.82%;高感(HS)芝麻种质资源2份,占供试种质4.55%。2、利用同源克隆技术克隆出SiPYL4、SiTLP基因。SiPYL4全长645bp,编码215个氨基酸,SiTLP全长681bp,编码227个氨基酸。3、对抗感芝麻品种进行菜豆壳球孢胁迫处理后,进行荧光定量分析,结果SiPYL4在抗病品种郑芝13中出现上调表达,在36 h时表达量较高,在感病品种冀9014中72h也出现了上调表达。SiTLP基因在抗、感品种中胁迫处理12h时同时出现表达量明显上升的情况,在感病品种冀9014中24h时表达量出现最高峰。随着胁迫时间的延长SOD、POD、CAT、H_2O_2含量也随之增加。4、超表达SiPYL4、SiTLP的转基因拟南芥与野生型相比有着较高的生长活性。菜豆壳球孢胁迫7天后野生型拟南芥感病症状明显,严重的整株枯死,转基因拟南芥只有底部莲座叶片有轻微枯黄。转基因拟南芥的活性氧清除能力也明显强于野生型拟南芥,因此推测SiPYL4、SiTLP基因在拟南芥抗菜豆壳球孢侵染过程中起关键作用。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S435.653
【部分图文】：

芝麻,分生孢子器,菌核,PDA培养基

图 1.3 菜豆壳球孢菌（A：菜豆壳球孢在 PDA 培养基上的形态；B：菜豆壳球孢菌核；C：菜豆壳球孢分生孢子器和分生孢子）Fig 1.3 (A: Macrophomina phaseolina morphology on PDA medium;B: Sclerotia ofMacrophomina phaseolina;C: Conidia and conidium of Macrophomina phaseolina)1.3.2 发病时期与症状在芝麻幼苗期，菜豆壳球孢最先侵染子叶时期的芝麻，特别是雨后天气放晴达到侵染的最佳时期，病苗根部会受到严重侵害直至死亡。在芝麻枯死后芝麻茎秆上会产生许多小黑点，这些小黑点就是菜豆壳球孢的分生孢子器和菌核。在芝麻成株期时，茎点枯病主要集中在芝麻开花及结蒴果时期。病原菌首先侵染芝麻的根部然后从根部往茎部逐渐蔓延，根部受侵害部位首先腐烂枯死，黑色的菌核布满芝麻的皮层，待病原菌蔓延至地表以上芝麻茎基部时，初期发病部位呈浅褐色，随着发病面积的扩大颜色逐渐加深，发病后期病斑颜色变为黑褐色，茎秆表面上密布黑色的菜豆壳球孢的分生孢子器。由于黑色小菌核侵入芝麻皮层内，导致芝麻茎秆组织受到严重坏死。发病严重的芝麻植株，从茎基部至芝麻顶部甚至全株叶片都会枯萎卷缩[33]。

序列,全长克隆,基因组DNA,芝麻

根据本实验室前期豫芝 11 与 Mp2010028C 苗期互作的转录组测序结果，拼接的 SiPYL4 和 SiTLP 序列，在芝麻基因组数据库中进行 Blast 比对得到一致性为百分之百的序列，在 NCBI 中的编号分别为 SiPYL4：LOC105167014，SiTLP ： LOC105157575 。其中 SiPYL4-like(Sesamum indicum abscisic acidreceptor)注释为芝麻脱落酸受体 PYL4 类似蛋白，全长 972bp,位于芝麻 7 号染色体（LG7:10587814:10588455:- ），SiTLP（Sesamum indicum thaumatin-likeprotein ）注释为芝麻类甜蛋白基因，全长 920bp, 位于芝麻 1 号染色体（LG1:6869724:6870404:+）。以郑芝 13 芝麻叶片 cDNA 为模板，分别以引物SiPYL4-F/R、SiTLP-F/R 克隆 SiPYL4、SiTLP 基因的 cDNA 全长片段；以引物SiPYL4-F/R、SiTLP-F/R 克隆 SiPYL4-like、SiTLP 基因的 DNA 基因组全长，扩增结果显示 SiPYL4、SiTLP 基因的 cDNA 全长和 DNA 基因组全长片段大小相等，PCR 扩增结果如图 3.1A 和 B。其中 SiPYL4 基因片段为 645bp、SiTLP基因片段大小为 681bp。又分别在抗茎点枯病芝麻品种：郑芝 13、新蔡选抗、商水农家种、豫芝 4 号、豫芝 11，感病品种：冀 9014、Fy1201、Fy1202、晋芝 3 号中进行 SiPYL4、SiTLP 基因的扩增，结果如图 3.2A和 B。

基因,抗性品种,分子克隆,芝麻

3 芝麻 SiPYL4、SiTLP 基因的分子克隆与鉴定为 SiTLP 基因）B:（M 为 DL2000bp DNA ladder marker、1~2 泳SiPYL4 基因，3~4 泳道为 SiTLP 基因）。.1 A: Full-length cDNA fragment of SiPYL4 and SiTLP genes;B: Full-length clonSiPYL4 and SiTLP gene DNA genome): A (M is DL2000bp DNA ladder marker, lane 1~2 is SiPYL4 gene, lane 3~4 is Si is DL2000bp DNA ladder marker, lane 1~2 is SiPYL4 gene, lane 3~4 is SiTLP
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