杀稻瘟菌素的成熟机制及产量提高研究

发布时间：2024-01-29 17:42

　　稻瘟病作为严重的稻类疾病,感染稻类的叶、茎、梗甚至根处,传播十分迅猛,一旦感染某个地区,再也无法被根治。杀稻瘟菌素对霉菌和酵母菌有良好的抑制活性,防治稻瘟病的效果优于有机汞农药,在日本很快被用于替代制剂防治稻瘟病。目前,杀稻瘟菌素广泛应用于真核细胞转基因筛选研究中,具有良好的商业价值。Mark Zabriskie课题组克隆了杀稻瘟菌素的生物合成基因簇,测序并推导了它的生物合成途径,但由于其原始产生菌无法进行遗传操作,有关杀稻瘟菌素生物合成基因簇的基因功能所知甚少。杀稻瘟菌素(BS)生物合成过程中检测到中间代谢产物脱甲基杀稻瘟菌素(DBS)、亮氨酰脱甲基杀稻瘟菌素(LDBS)、亮氨酰杀稻瘟菌素(LBS)。前期研究证明:BS或者DBS被亮氨酰化后,毒性显著降低,推测亮氨酰化是生物合成过程中一种有效的自我保护机制;BS生物合成中的最后一个中间体LBS上的亮氨酸,最终因被水解而成熟为杀稻瘟菌素。本研究主要围绕鉴定与研究LBS水解酶如何将LBS成熟为BS,以期完善对杀稻瘟菌素生物合成途径的认识,并为其产量提高和组分转化提供理论依据。本研究前期通过染色体步移及对基因簇两侧可能的水解酶基因进行了系列...

【文章页数】：172 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 文献综述
    1.1 链霉菌的异源表达简介
    1.2 氨肽酶N简介
        1.2.1 肽酶简介
        1.2.2 氨肽酶简介
        1.2.3 氨肽酶N简介
    1.3 核苷类抗生素简介
    1.4 抗性素产生菌的抗性机制简介
    1.5 抗性素的隐藏反应简介
    1.6 杀稻瘟菌素生物合成的研究背景
        1.6.1 杀稻瘟菌素简介
        1.6.2 杀稻瘟菌素的生物合成途径研究进展
        1.6.3 杀稻瘟菌素基因簇的异源表达
        1.6.4 杀稻瘟菌素原始产生菌的抗性机制及成熟机制介绍
    1.7 本研究的内容和目的
第二章 材料与方法
    2.1 菌株、质粒和引物
        2.1.1 菌株
        2.1.2 质粒
        2.1.3 PCR引物
    2.2 实验材料
    2.3 实验方法
        2.3.1 菌种的培养及保存
        2.3.2 大肠杆菌质粒的提取
        2.3.3 链霉菌质粒的小量提取
        2.3.4 大肠杆菌总DNA的少量提取
        2.3.5 链霉菌总DNA的少量提取
        2.3.6 聚合酶链式反应(PCR)
        2.3.7 DNA的酶切、回收、连接
        2.3.8 E.coli钙转感受态细胞的制备
        2.3.9 E.coli电转感受态细胞的制备
        2.3.10 E.coli钙转感受态细胞的转化
        2.3.11 大肠杆菌电转感受态细胞的转化
        2.3.12 两亲本杂交介导的质粒DNA跨属转移
        2.3.13 杀稻瘟菌素的液体发酵
        2.3.14 杀稻瘟菌素发酵液的纯化
        2.3.15 杀稻瘟菌素的生物活性测定
        2.3.16 杀稻瘟菌素发酵液的高效液相色谱法(HPLC)测定
        2.3.17 HPLC法测定杀稻瘟菌素BS的标准曲线
        2.3.18 细胞粗提液(CFE)和全细胞的制备
        2.3.19 LBS水解反应体系
        2.3.20 饱和硫酸铵沉淀活性组分
        2.3.21 蛋白质LC-MS/MS鉴定
        2.3.22 PCR-targeting的方法敲除大肠杆菌基因组的基因
        2.3.23 PCR-targeting的方法敲除链霉菌基因组的基因
        2.3.24 蛋白表达及纯化
        2.3.25 链霉菌总RNA的提取(细胞破碎法)
        2.3.26 链霉菌总RNA中基因组DNA的消化
        2.3.27 RNA的反转录
        2.3.28 链霉菌中基因的过表达
        2.3.29 利用CRISPR/Cas9-codA(sm)系统敲除链霉菌基因组的基因
        2.3.30 Western杂交
        2.3.31 生物信息学分析
第三章 亮氨酰化杀稻瘟菌素(LBS)水解酶的鉴定
    3.1 前言
    3.2 结果与讨论
        3.2.1 LBS水解酶基因存在于杀稻瘟菌素(BS)基因簇之外
        3.2.2 LBS水解酶基因广泛存在于微生物中
        3.2.3 在E.coli DH10B中追踪水解活性组分
        3.2.4 LC-MS/MS数据分析出5 个潜在的LBS水解酶
        3.2.5 大场杆菌中的PepN单独负责水解LBS为 BS
        3.2.6 PepN的体外功能研究
        3.2.7 PepN的稳定性研究
第四章 链霉菌中多组分LBS水解酶在BS成熟中的作用
    4.1 前言
    4.2 结果与讨论
        4.2.1 生物信息学功能分析,S.lividans WJ2 中有三个PepN同源蛋白
        4.2.2 PepN1sli是负责LBS水解成BS的主要水解酶
        4.2.3 S.lividans WJ2 中,PepN1sli的过表达能够提高BS产量
        4.2.4 S.griseochromogenes中三个PepN同源蛋白的活性分析
        4.2.5 S.lividans WJ2 中,三个pepN同源基因的体内敲除突变株构建
        4.2.6 pepN同源基因缺失突变株的体外水解活性及发酵验证
        4.2.7 生物信息学功能分析及体外活性验证,PepA具有微弱LBS水解活性
        4.2.8 饱和硫酸铵沉淀的方式对LBS水解酶进一步挖掘
第五章 原始产生菌S.griseochromogenes和异源表达菌S.lividans WJ2中LBS水解酶活性对BS产量及组分的影响
    5.1 前言
    5.2 结果与讨论
        5.2.1 水解酶主组分PepN1 的体外活性差异比较
        5.2.2 水解酶主组分PepN1 的稳定性比较
        5.2.3 水解酶主组分PepN1 的体内活性差异比较
        5.2.4 发酵过程中pH值的监测
        5.2.5 Western杂交分析PepN1 的体内表达量差异
第六章 杀稻瘟菌素产量的提高
    6.1 前言
    6.2 结果与讨论
        6.2.1 突破生物合成限速步骤,单独过表达基因簇内9 个功能基因
        6.2.2 提高前体cytosine供给,单独过表达BlsMF19Y
        6.2.3 提高前体UDP-葡萄糖醛酸供给,单独过表达UDP-葡萄糖脱氢酶
        6.2.4 提高前体Leu-tRNALeu供给,串联过表达Bls J、Bld A及 LRS
        6.2.5 提高中间体LDBS浓度,串联过表达BlsK、BlsJ、BldA及 LRS
第七章 总结与展望
    7.1 本研究工作总结
    7.2 本研究主要创新点
    7.3 进一步工作和展望
        7.3.1 其它低活性LBS水解酶的鉴定
        7.3.2 Fe²⁺刺激细胞上的水解酶活性的基因的鉴定
        7.3.3 小分子肽类次级代谢产物异源表达宿主的验证
参考文献
致谢
攻读博士学位期间发表的学术论文
附录



本文编号：3888549