聚乙二醇介导咖啡炭疽菌遗传转化体系的建立

发布时间：2024-04-08 04:09

　　【目的】建立高效制备咖啡炭疽菌原生质体及聚乙二醇(PEG)介导的遗传转化体系的方法,为开展咖啡炭疽菌的致病分子机理研究打下基础。【方法】以咖啡炭疽菌野生型菌株BSC2-2为试验材料,通过PEG介导原生质体转化法将含有氯嘧磺隆标记和绿色荧光蛋白报告基因(GFP)的质粒pCB1532-G转入BSC2-2原生质体中,对获得的转化子进行遗传稳定检测、PCR分子检测和激光共聚焦显微观察。【结果】BSC2-2对氯嘧磺隆的耐受浓度为200.0 mg/L。最佳遗传转化体系为:28℃下用2.5%裂解酶酶解BSC2-2菌丝2 h,收集原生质体,再经MTC缓冲液冲洗重悬后将质粒pCB1532-G转入原生质体,在RM培养基中混匀再生,获得转化子。GFP基因的PCR扩增和分生孢子荧光观察结果表明,GFP基因已成功插入并整合到咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中。转化子与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病力上无明显差别,表明GFP基因在咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中稳定遗传。【结论】成功建立了PEG介导的咖啡炭疽菌遗传转化体系,获得与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病性上无明显差别的转化子,为后续研究咖啡炭疽菌的基...

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【部分图文】：

图1BSC2-2对氯嘧磺隆的敏感性

由图2可知，在单独使用2.5%裂解酶作为细胞壁降解酶处理菌丝时，获得的原生质体产量最高，达4.03×105个/mL，显著高于其他处理的原生质体产量（P<0.05，下同），其次是2.5%溶壁酶，2.5%蜗牛酶的效果最差，只获得0.13×105个/mL的原生质体；2.5%裂解酶+....

图2降解酶对原生质体产量的影响

图1BSC2-2对氯嘧磺隆的敏感性2.2.2裂解酶浓度对原生质体产量的影响

图3裂解酶浓度对原生质体产量的影响

将所有的转化子在含氯嘧磺隆的PDA培养基上连续培养10代后，发现所有的转化子仍可表现出对氯嘧磺隆的抗性，表明转化子所获得的抗性能稳定遗传。利用GFP基因的特异性引物GFP-F/GFP-R对随机挑取的15个转化子进行PCR扩增，结果（图5）显示，所有转化子和质粒均能在730bp处....

图4酶解时间对原生质体产量的影响

图3裂解酶浓度对原生质体产量的影响图5咖啡炭疽菌转化子GFP基因PCR检测结果

本文编号：3948470